食源性致病菌交叉适应现象及分子机制的研究进展

陈 欣，胡玲萍，应宇斌，刘佳琳，胡亚芹，丁 甜*

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，南方果蔬保鲜技术集成科研基地，浙江省健康食品制造与品质控制国际合作基地，浙江 杭州 310058）

在食品生产、加工、贮存和烹饪过程中，食源性致病菌会遭遇一系列对微生物生长和存活产生不利影响的胁迫，包括物理胁迫（高温、高压或高渗透压）、化学胁迫（酸或消毒剂）、生物胁迫（细菌素）等[1]。随着消费者对食物营养和风味品质要求的提高，现代食品加工的发展趋势已经转变为几种较为温和的加工方式相结合来取代施加单一的、极端胁迫的方式，其中的典型应用为“栅栏技术”。它通过食品加工过程中多重胁迫耦合的方式对食源性致病菌进行灭活和控制，从而延长食品的保质期，确保食品安全[2-4]。但是许多研究发现细菌可以感受到周围环境的变化，并通过改变表型或基因表达来做出适应性反应[5-6]。除了单一的应激反应外，越来越多的研究发现初步暴露于一种给定的应激可以为细菌适应另一种应激提供有利的条件。这些预先适应亚致死胁迫的细菌细胞会做出应激反应，帮助细菌修复自身损伤，维持细胞内稳态，从而使细菌能够增强对之后遭遇的其他逆境的耐受能力，这种现象称为交叉适应现象[7-9]。

食源性致病菌在食品加工和贮藏中的相关胁迫诱导下发生交叉适应的现象十分普遍，使细菌极易在后续杀菌或抑菌处理中得以存活，从而成为食品安全潜在的风险。一些常见的食源性致病菌如单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）等在遭受传统的胁迫因子如酸、营养限制等条件下，对随后的高温胁迫、盐胁迫、细菌素等依旧能产生较强的耐受性[10-16]。同时，近几年的研究发现，即便是已经受到了传统胁迫处理的食源性致病菌，在面对新型的食品加工技术时也能产生交叉适应现象（表1）。交叉适应现象可以使细菌在整个食品加工过程中得以生存，从而导致严重的食品安全风险。本文综述了交叉适应现象对于致病菌细胞的影响及其分子机制，总结常见食源性致病菌的交叉适应现象情况，并对于如何减轻交叉适应现象进行展望，以期进一步丰富微生物交叉适应理论体系，为避免因细菌耐受性提高而导致的杀菌不彻底现象和进一步优化食品加工工艺条件提供理论依据。

1 常见食源性致病菌的交叉适应现象

1.1 单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌是最早被发现产生交叉适应现象的菌株[22]。在肉类和乳制品等食品中，经常发生由李斯特菌污染引起的食品召回和李斯特菌病的暴发[23-24]。Shen Qian等[25]在肉汤、牛奶和胡萝卜汁等不同的食品介质中研究了酸胁迫适应诱导的单核细胞增生李斯特菌在不同温度下对月桂酸精氨酸的交叉保护作用及其稳定性，发现酸胁迫适应的细胞在22 ℃肉汤或4 ℃的牛奶和胡萝卜汁中存活的菌落浓度比未适应的细胞高约2（lg（CFU/mL））。酸适应的交叉保护效应也使单核细胞增生李斯特菌在常用消毒剂如乙醇或季胺化合物中存活的菌落浓度提高了1～3（lg（CFU/mL））[26]。Smith等[27]发现，预先受到酸处理的单核细胞增生李斯特菌提高了在低酸性食品（如白干酪、酸奶、橙汁和色拉酱）中的存活率以及对于非热灭菌技术（如辐射、高静压技术）的抵抗力[28-29]。

外界环境胁迫能增强单核细胞增生李斯特菌对人体消化道内胁迫的耐受性。Begley等[30]将单核细胞增生李斯特菌细胞暴露在酸、热、盐或十二烷基硫酸钠的温和刺激下，这些刺激显著增强了其耐受人体肠道内胆盐的能力。Ferreira等[31]发现酸适应的单核细胞增生李斯特菌在pH值为2.5的胃液培养基中也具有生存能力，说明酸适应的细胞在人体摄入后有机会通过人体胃屏障存活。

1.2 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是评价食品和加工环境卫生的一个常规检测菌种，因为它既存在于相当多类型的食品中，如肉类、乳制品、鱼类、即食食品等[32-33]，也是人类皮肤和黏膜的共生有机体。食品加工人员可能将携带在鼻子或手上的产肠毒素金黄色葡萄球菌通过人工接触或呼吸道分泌物等途径污染食品，这大大增加了金黄色葡萄球菌污染食品的机会[34]。

许多传统的食品加工贮藏手段均能诱导金黄色葡萄球菌产生交叉适应现象。Cebrian等[35]发现酸-热、酸-H2O2、碱-H2O2、热-酸和热-H2O2都可以引起金黄色葡萄球菌交叉适应现象的产生。随后，他们又用酸、碱、H2O2、NaCl、冷热胁迫对金黄色葡萄球菌进行短期（2 h）预处理，再使用脉冲电场处理，发现高温和碱胁迫联合处理下的金黄色葡萄球菌能够产生交叉保护作用[36]。除此之外，在食品加工或生产环境中很可能由于抗生素的不适当使用，而使越来越多金黄色葡萄球菌产生抗药性，从而诱导交叉适应现象的产生。异丙沙星、氯霉素、红霉素、克林霉素、四环素、苯唑西林、头孢西丁和庆大霉素等常见的抗生素能够提高金黄色葡萄球菌在酸性（pH 1.5）、高温（63 ℃）和渗透压（质量分数30% NaCl）条件下的存活率[37]。这些耐药性金黄色葡萄球菌能够增强对致死性胁迫的耐受能力，提高在食品加工中的残存机率，对食品安全和消费者的健康造成潜在威胁。

表1 新型食品加工技术引起的交叉适应现象Table 1 Cross-adaptation causes by new food processing technology

1.3 大肠杆菌

大肠杆菌O157:H7通常能够在一些酸性食物，如酸性水果、发酵食品中生存[38]。Lee等[39-40]在实验室培养基和模拟腌制黄瓜体系中添加NaCl（质量分数3%），相较于没有添加NaCl的对照组，前一组中受到亚致死性盐胁迫的大肠杆菌能够显著增加其在醋酸体系中的存活率。Ungartti等[41]发现pH 5.5的非缓冲溶液肉汤中，酸适应大肠杆菌O157:H7能提高其耐热性（58 ℃）。Wambui等[42]研究了不同胁迫对持水牛肉中的大肠杆菌O157:H7热失活情况的影响，相比于非适应对照，冷和干燥胁迫适应的细胞对热敏感，但酸胁迫适应的细胞能增强其耐热性。

除此之外，新兴抗菌技术也能诱发大肠杆菌O157:H7产生交叉保护现象。Aertsen等[43]发现在50 ℃下热处理15 min的大肠杆菌细胞增加了对250 MPa高静水压处理的抵抗力。Wang Qingyang等[44]设计了基于UV-A/UV-C和GA联合处理大肠杆菌O157:H7的新抗菌方法，探究预先暴露于某些亚致死胁迫的大肠杆菌O157:H7对这种新抗菌方法的抵抗力。结果发现预先暴露于热胁迫的大肠杆菌O157:H7对新抗菌方法的抵抗力增加，而预先暴露于氧化应激的细菌对这种处理方法的敏感性没有影响，这可能与超氧化物歧化酶等酶的合成增加和一般应激反应调节因子的上调有关。

1.4 沙门氏菌

沙门氏菌属中的常见血清型如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis），宿主特异性极弱，既可感染动物也可感染人类，常通过动物性食品引起人类中毒[45]。肉类生产加工过程中经常采用有机酸对微生物进行消减，如在牛羊肉的屠宰线末端，以有机酸喷淋的形式使胴体菌数减少[46]，或者在肉制品生产的过程中添加一定比例的盐来达到抑菌的效果[47]。Karolenko等[48]发现沙门氏菌暴露于温和酸刺激条件时可通过酸适应来诱导耐热性，同时提高对盐胁迫的耐受性。这种酸-热、酸-盐的交叉适应组合的产生很可能会使灭菌效果大大减弱，从而增加沙门氏菌在食品中的残留风险。沙门氏菌也常存在于蔬菜、水果等生食表面，并且可以在冰箱中存活3～4 个月。Shah等[49]发现低温（5 ℃）处理5 h的沙门氏菌能增强对热的耐受性，从而在随后施加的酸胁迫（pH 4、90 min）过程中得以存活。

1.5 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）又称致病性嗜盐菌，广泛存在于近岸海水和鱼贝类食物中。由副溶血性弧菌引起中毒的食品主要为海产品，以墨鱼、虾、贝类最多见，其次为盐渍食品和肉类[50]。Chiang等[51]发现预先受到酸胁迫（pH 5.5、90 min）的3 株副溶血性弧菌（690、BCRC 13023、BCRC 13025）相较于未处理对照组，对于随后施加的高温（47 ℃）、乙醇（体积分数8%）和盐（质量分数20%）胁迫具有更强的耐受能力。黄小鸣等[52]用80～250 MPa超高压处理原始敏感副溶血性弧菌菌株，筛选得到耐高压菌株，随后发现在多种胁迫条件下（如温度、NaCl、有机溶剂、有机酸）耐高压副溶血性弧菌菌株均能正常生长。

1.6 志贺氏菌

志贺氏菌（Shigella castellani）是一类革兰氏阴性短小杆菌，是引起人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。其中能够引发食物中毒的志贺氏菌主要是福氏志贺氏菌，可以通过受到污染的热肉制品、饮用水等引起人体食物中毒[53]。福氏志贺氏菌在经过pH 4.5的盐酸处理之后，能够产生明显的酸适应性，同时对它的基因表达情况进行检测，发现pspE、nanT、clpB、lldp、sitA、cstA基因产生明显上调现象，而这些基因都与交叉适应现象的产生有关[54]。当志贺氏菌进入人体后，作为具有强耐酸性的肠杆菌，它能够适应肠道内的低酸环境，并抵抗肠道内遭遇的其他胁迫（渗透压、胆盐）[55]。

2 交叉适应现象对食源性致病菌的影响

2.1 对细胞膜的影响

细胞膜是微生物抵御它们所面临的胁迫环境条件的第一道屏障。因此，调节细胞膜的组成和物理性质，在抵消外界胁迫的不利影响时起着重要的作用。许多研究表明膜流动性和细菌抗逆性之间存在联系[56-58]。目前研究最多的是温度胁迫对细菌膜脂肪酸组成和膜流动性的影响。膜流动性降低会使细菌耐热性增强，反之亦然[57,59-61]。低温也能影响细菌的膜流动性，因此，细菌可以通过增加其膜中熔点较低的脂肪酸的比例，例如增加不饱和脂肪酸含量来维持膜功能[62]。蜡样芽孢杆菌即会通过显著增加不饱和/饱和脂肪酸的比例来适应寒冷[63-65]。低温也能诱导酸适应单核细胞增生李斯特菌的主要的毒力调节因子prfA上调，从而增强其上皮细胞的侵袭能力和感染秀丽隐杆线虫（另一种寄主模式系统）的能力[62]。细菌的酸胁迫耐受能力与细胞膜的流动性之间也存在关联[66]。Alvarez-Ordóñez等[57,67]用傅里叶变换红外光谱监测了鼠伤寒沙门氏菌细胞膜成分随酸pH值的变化对细胞膜流动性的实际影响，发现暴露在不同种类的胁迫下会导致相当大比例的细胞膜不饱和脂肪酸转化为它们的环状衍生物，即环丙烷脂肪。环丙烷脂肪对细菌膜变化的贡献还不完全清楚，但它可能增加了生物膜结构和动力学方面的稳定性，并限制了酰链的整体流动性，从而降低了膜的流动性，控制环境的不良分子渗透进入细胞[57]。这些膜成分的变化导致细菌表现出在致死性酸和热胁迫组合的情况下更高的生存能力。

2.2 对DNA的影响

食源性致病菌经食品工业中常见加工保鲜手段处理后，细胞内的DNA会受到损伤，甚至引起DNA链的断裂，从而抑制其复制过程。然而在某些非致死性胁迫环境下，致病菌的DNA虽然受到损伤，但SOS反应、DNA保护蛋白（DNA-binding protein，Dps）等应激响应途径（详细见3.2、3.3节）也被激活。这些应激响应途径能够起到DNA修复作用或参与停滞复制叉的重新启动，从而增强致病菌对于致死性胁迫的耐受能力[68]。Tandon等[69]发现一些常用的氧化消毒剂，如H2O2和次氯酸钠，可诱导单核细胞增生李斯特菌的细胞内活性氧物质的形成，如超氧化物和羟自由基，从而引起DNA损伤。而此时的Dps就可以通过铁氧化酶活性来保护单核细胞增生李斯特菌免受氧化逆境。非致命性剂量的UV照射，高温也会导致单核细胞增生李斯特菌的DNA受损，诱导细菌出现交叉适应现象，对随后施加的H2O2、酸、乙醇和热产生耐受性[28,70]。Chatterjee等[71]发现金黄色葡萄球菌在环丙沙星的诱导下，细胞内的双链DNA断裂，复制分叉停滞，而SOS反应能激活recA和SSB基因保护和稳定分叉的DNA，为金黄色葡萄球菌产生交叉适应现象提供可能。

2.3 对应激基因的影响

食源性致病菌会在多个外界胁迫诱导下，整合相应的应激反应，通过多个调控通路来控制应激基因的表达，从而做出对外界胁迫的响应。Begley等[72]的微阵列实验揭示了单核细胞增生李斯特菌对盐胁迫的适应导致opuCA、Betl、bilEAB、bsh的转录水平上调，这些应激基因也帮助提高单核细胞增生李斯特菌在胆汁中耐受性。He Shoukui等[73]发现乙醇胁迫会使肠炎沙门氏菌酸休克蛋白基因SEN1564A和rpoS的表达量显著上调，有助于提高其在苹果酸中的存活率。Hamilton等[74]测定了应激状态下鼠伤寒沙门氏菌生物膜的转录图谱，观察到433 个基因（约占基因组的10%）的表达与浮游状态下细胞相比在生物膜中显示出2 倍或更大的变化。几个编码调节全局的基因（如rpoS调节子）在应激状态下的鼠伤寒沙门氏菌的生物膜细胞中超过25%有上调现象。这些上调的基因包括对氧化应激（lexA、mrsA、sodA、sodC、gloA）、热休克（clpA和clpX）、DNA复制和修复（recA、mug、pbrB）以及细胞被膜应激（PSPB）作出反应的基因。Shah等[75]发现对数期培养的鼠伤寒沙门氏菌对冷胁迫（5 ℃、5 h）的预适应显著提高了其在随后酸胁迫（pH 4、90 min）下的存活率。基因表达谱显示，冷胁迫的预适应导致已知在抗酸胁迫中起作用的基因表达上调，包括与谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸和赖氨酸运输和代谢相关的多个基因。几个与氧化应激相关的基因也表达上调，这些基因编码的蛋白质被证明可以防止由于酸暴露造成的二次氧化损伤。

2.4 对致病力的影响

致病菌在食品加工过程中受到各种亚致死胁迫（如饥饿、极端温度、有机酸等）后所产生的应激反应可能会影响细菌菌株的致病能力。Yoon等[76]发现预先暴露于NaCl中的鼠伤寒沙门氏菌增加了对结直肠腺癌（Caco-2）细胞的侵袭，也同时增加了其对随后热胁迫的抵抗力。在发生交叉适应的过程中，一些应激反应调节因子（如革兰氏阴性菌中的RpoS、革兰氏阳性菌中的SigB）通常会参与对应食源性病原菌的毒力水平的调节，起到协同转录的调控效果，从而增强特定毒力因子表达，有助于致病菌进入宿主体内生存[77]。Werbrouck等[78]的研究成果发现，单核细胞增生李斯特菌能够在酸胁迫条件下激活SigB，同时也改变了毒力基因inlA的表达水平，并显著增加了细菌侵袭Caco-2细胞的能力。SigB还可以调节李斯特菌主要毒力调节因子PrfA的转录，还有几个毒力基因能够同时受PrfA和SigB的共同调控，包括编码内素和胆盐水解酶的基因[79]。Foster等[80]发现低pH值和高温等几种环境条件能诱导沙门氏菌的Rpos应激因子进行响应，Rpos能够调节质粒毒力基因（SPV），促使SPV毒力蛋白的表达，这些耐热和耐酸的肠炎沙门氏菌PT4细胞对小鼠和鸡的毒力和侵袭力均较强[81]。此外，某些特定的应激基因/因子也可能会影响食源性致病菌的毒力。编码渗透压转运蛋白系统的opuC突变使单核细胞增生李斯特菌对盐胁迫更加敏感，并显著降低了该细菌在老鼠小肠上部的定殖能力[2]。金黄色葡萄球菌的PerR因子作为特定的H2O2感受器，所调节的基因可以将金黄色葡萄球菌对氧化胁迫的抗逆性和致病性联系起来形成复杂的共同调节过程，增强其在粒细胞内存活的能力[82]。

3 食源性致病菌产生交叉适应现象的分子机制

3.1 σ因子

感知和应对环境变化的能力对于致病菌的生存至关重要。当致病菌受到亚致死胁迫的时候，所诱导产生的应激基因很可能与随后施加的致死性胁迫所产生的应激基因存在高度重叠。因此，一旦外界胁迫条件改变，致病菌就可以直接抵抗随后施加的致死性胁迫，而不需要重新产生相应的应激基因。其中起到总调控作用的是σ因子。它是RNA聚合酶全酶的可分离亚基，能将细菌RNA聚合酶引导至位于转录起始点上游10 个和35 个碱基对的特定启动子元件上，促使启动子识别和转录启动，产生相应的应激调控机制[83-84]。

σ因子根据系统发育关系和蛋白质结构域结构，可分为4 个不同的组（σ1～4）：负责大多数基因在有利条件下表达的管家σ因子（σ1）以及结构上相关的可变σ因子（σ2～4）。尽管大多数细菌都含有管家σ因子，可变σ因子在不同的致病菌生物体中数量差异很大[85]。可变σ因子通常作用于启动特定的基因组以响应适当的信号。它们的功能可以分为3 类：应激响应、发育和辅助新陈代谢。其中，应激响应功能可以通过对总调控可变σ因子（σ2）和胞外功能σ因子（extracytoplasmic function Sigma factors，ECF σ factors）（σ4）进行调控。它们引导RNA聚合酶结合到不同的启动子位点，调节基因子集的表达，其表达产物能促进致病菌表型或基因型改变，从而适应外界胁迫因素的变化[86]。应激响应相关调控因子及其功能见表2。

表2 应激响应相关调控因子及其功能Table 2 Stress-related regulatory factors and their functions

3.1.1 总调控可变σ因子

总调控可变σ因子在革兰氏阳性菌中的存在形式为RpoS（σS），革兰氏阴性菌中为SigB（σB）。Nelson[95]和Ait-Ouazzou[96]等通过构建大肠杆菌rpoS基因缺失菌和单核细胞增生李斯特菌sigB基因缺失菌来比较它们在施加了亚致死条件之后对致死性条件的耐受能力。rpoS和sigB缺失菌株相较于完整菌株在预先受到精油抑菌或酸处理再接受脉冲电场或者热处理之后，它的细菌数量减少程度远高于完整菌株。这说明RpoS和SigB这两种Sigma因子能够增强细菌对于之后的致死性胁迫的应激能力。

由rpoS编码的总调控可变σ因子RpoS能在多种应激条件下对革兰氏阴性菌起到保护作用。Hengge-Aronis等[97]发现RpoS在稳定期大肠杆菌中控制240多个基因的转录，这些基因编码胁迫管理蛋白、代谢酶、膜蛋白和调节蛋白，对随后受到各种胁迫条件，如饥饿、高渗透压、pH值降低、高温或低温起到调控作用。也能通过RpoS的调控提高鼠伤寒沙门氏菌在酸、氧化应激、热、渗透压等胁迫条件下的存活率[98]。类似地，另一种由sigB编码的SigB因子在革兰氏阳性菌如芽孢杆菌、李斯特菌等中起到调节细胞应激反应的作用。枯草芽孢杆菌中已经鉴定出至少100 种依赖于SigB的应激蛋白，它们对各种环境胁迫具有保护作用[99-100]。Hain等[101]发现单核细胞增生李斯特菌的SigB因子能通过胁迫条件（盐、乙醇、有机酸、热休克）激活，诱导调控基因转录，其中包括编码溶质转运蛋白、细胞壁蛋白、通用应激蛋白和转录调节因子的基因，以及参与渗透调节、碳代谢、核糖体和包膜功能的基因，从而触发保护性响应。

3.1.2 ECF σ因子

ECF σ因子存在于细胞膜上，可以调节细胞膜的相关过程，如分泌、胞外多糖的合成、铁离子的输入或排出、胞外蛋白酶的合成等。在没有逆境胁迫的情况下，它通过抗σ因子（ECF活性的负面操纵子）抑制而保持非活性。当细胞外产生逆境，会引发细胞表面或细胞内的蛋白水解级联反应，通过信号感应和传导使相应的抗σ因子蛋白水解或构象变化失活，从而导致ECF σ因子的释放。释放后的ECF σ因子可自由结合至DNA，并指导RNA聚合酶转录特定应激响应基因[102-104]（图1）。

图1 ECF σ因子应激响应过程示意图Fig.1 Schematic diagram of response of extracytoplasmic function Sigma factors to stress

大肠杆菌中的RpoE（σE）是最早被发现的ECF σ因子，其也是革兰氏阴性菌中最常见的ECF因子，其活性是由外膜错误折叠的蛋白质诱导产生的[105]。因此，RpoE调节子含有折叠酶、蛋白酶、脂多糖生物合成蛋白和伴侣蛋白的基因[106]。这些基因是维持细胞膜完整性所必需的，而细胞膜完整性可以帮助致病菌更好地应对外界胁迫诱导的损伤。而革兰氏阳性菌中的ECF因子种类、数量相差很大，除了通过维持细胞膜完整性以应对胁迫，特定胁迫需要相对应的特殊ECF因子来进行应激调控。例如苦草芽孢杆菌对溶菌酶的抗性需要通过σV诱导dltABCDE和oatA的表达而产生[107]。此外，ECF σ因子在革兰氏阳性菌或阴性菌中都存在冗余现象，这样的冗余现象可以在交叉适应现象中起到一定的作用。枯草杆菌中σM、σW和σX的重叠调控在面对不同的抗菌化合物引起相似类型的损伤时，只需要启动一套共同的防御措施[108]。ECF σ因子AlgU/T能刺激铜绿假单胞菌生成黏液表型，使其增强对多种抗菌剂的耐药性，也能对随后由抗菌剂引起的氧化应激产生保护作用[109]。

3.2 双组分系统

双组分系统（two-component systems，TCS）是致病菌感知外界胁迫信号，将信号分子传导至菌体内部，从而激发相应调控机制的重要途径。在交叉适应中，一个TCS感知到多种应激信号后，可以通过立体的信号传递网络进行信号放大，再通过激活其他TCS和/或σ因子等体系间接达到调控效果[110]。

TCS由两部分组成，一部分是用于胁迫感应的膜结合组氨酸激酶，另一部分是用于调节DNA转录的反应调控因子[111]。通常对于胁迫信号的检测和传导如下：检测到特定信号后组氨酸激酶发生自磷酸化，从而使组氨酸磷酸转移（histidine-phosphotransfer，DHp）域中的保守组氨酸残基磷酸化，该残基磷酸转移至同源反应调控因子的接受（receiver，REC）域上与天冬氨酸残基结合。反应调控因子的磷酸化诱导其构象改变，从而调节其活性，并启动应激响应基因的转录[112]（图2[113]）。但革兰氏阴性菌的某些特定的TCS响应机制会有所不同，通过激活另一系统或蛋白启动应激响应。PhoP/PhoQ系统在响应环境中的H＋信号后，能够激活RstA/RstB系统，进而促进Fe2＋转运蛋白的生成和细胞对Fe2＋的摄取，可见RstA/RstB和PhoP/PhoQ系统能帮助细菌应对酸性环境下Fe2＋胁迫。EnvZ/OmpR系统作为渗透胁迫相关的TCS，当渗透压发生变化时，磷酸化的OmpR能够调节OmpF和OmpC两种孔道蛋白的表达，OmpC和OmpF在外膜上形成一个通道，能够允许小分子质量的亲水性物质通过被动运输扩散进到膜内[114]。

TCS除了可以用来应对外界环境的变化，也能够调节细胞毒力情况。革兰氏阴性菌常见的PhoP/PhoQ、OmpR/EnvZ、PmrA/PmrB、EvgS/EvgA等TCS除了与诱导菌株抵抗酸、抗菌肽、高盐胁迫的能力有关之外，还可以参与细胞Mg2＋和毒力的调控[115-118]。革兰氏阳性菌如产气荚膜梭菌的VirS/VirR系统和金黄色葡萄球菌双组分系统的反应调节因子AgrA也能调控细菌毒力因子的表达[119-120]。

图2 TCS对胁迫信号的传导示意图[113]Fig.2 Schematic diagram of the transduction of stress signal by two-component systems[113]

3.3 SOS反应

当致病菌受到亚致死胁迫之后，通常会引起DNA损伤或复制叉坍塌导致ssDNA暴露，这时就会引发SOS反应[121]。SOS反应是通过诱导一系列能够处理DNA损伤的基因表达，从而对损伤的DNA进行修复的整体应答机制。在不同的革兰氏阳性菌或阴性菌中，SOS反应所诱导的调控基因种类相差较大。Kelley[122]对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌SOS调控子的比较分析显示，重叠之处仅有8 个基因，而这两个物种的SOS调控子都包含30 多个基因。SOS反应过程通常都受LexA和recA基因产物的调控，LexA是一种SOS转录阻遏物，在发生SOS反应之前与SOS调控基因的操纵子位点结合。RecA可以检测到DNA损伤的存在，并且非特异性地与单链DNA结合并导致LexA的自动催化裂解，随后使SOS反应调控基因的表达不再受到抑制，诱导一系列处理DNA损伤及其在细胞内反应的基因的程序性表达[123-125]。

食品加工过程中，常使用各种依赖于致病菌DNA损伤的表面处理或清洁剂，如UV或氧化剂。而这些非致死剂量的UV或氧化剂处理，可能导致致病菌出现交叉适应现象，从而增加其在消毒处理期间的存活机会[126-128]。预先暴露于UV的乳酸乳球菌能对酸（pH 4.0）、乙醇（20%，V/V）、H2O2（15 mmol）或高温（52 ℃）产生交叉保护作用，随后再用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳比较UV（100 J/m2）处理和未处理培养物的全细胞蛋白提取液，发现UV处理后，至少诱导了14 种多肽对损伤作出反应。在这个交叉适应过程中，致病菌的SOS反应受到激活。Chen Jun等[129]发现氧化应激适应的荧光假单胞菌SN15-2在随后的高温条件下死亡率显著低于对照组，表明氧化应激适应可以提高它们的耐热性，而其中参与胁迫防御反应的差异表达蛋白质是由SOS反应引起的。因此，在多种应激诱导DNA损伤（UV、氧化应激）或复制叉失速（热应激）中，SOS反应能激活一系列保护和稳定分叉的基因（如recA和SSB）以及通过核苷酸切除或重组修复机制来处理有害损伤的基因（如uvrA、uvrB、ydjQ、UvrD、recN和ruvAB），这对于致病菌在食品加工环境中保存压力和消毒处理的生存起到重要作用[130-132]。

3.4 DNA保护蛋白

饥饿细胞的Dps作为一种新的DNA结合蛋白，最早由Almron发现它能在大肠杆菌细胞遭受饥饿胁迫时起到调节和保护作用[133]。随后，有许多研究发现Dps在许多细菌细胞暴露于严重的外界环境胁迫时，能够为其提供保护。它提供多方面保护的能力是基于两个固有属性：DNA结合能力和铁氧化酶活性。这也使得Dps在致病菌受到酸和碱冲击、铁和铜毒性、高盐或辐射诱导的应激条件方面起到重要作用[134-135]。

当致病菌受到亚致死胁迫之后，它的DNA大分子会受到一定程度的损伤，这时候Dps就会在自我聚集的同时和DNA共同结晶形成Dps-DNA复合体。Wang Binbin等[136]用荧光定量聚合酶链式反应检测了6 种代表性Dps：DprA、SsbA、RadA、RadC、RecA和RecQ在乳酸乳球菌中先受到红霉素再受到酸胁迫时的表达情况。结果显示，在乳酸乳球菌出现交叉适应现象时，这几种Dps均出现了表达上调的情况。说明Dps在其中发挥了与外源单链DNA结合以维持其稳定性的作用，同时在强酸胁迫条件下，Dps也能保护暴露的细胞免受DNA链断裂而死亡。但当致病菌受到某些外界胁迫变化（铁限制、氧化胁迫）时，由于不同的防御蛋白的表达，在不同的物种中可能会遇到不同的情况。某些细菌（如李斯特菌）仅含有Dps蛋白，因此在Dps蛋白的铁氧化酶位点，每还原一个H2O2分子就有两个亚铁离子被氧化，从而避免了通过Fenton反应形成羟自由基，保护细菌免受H2O2损伤[137]。而有些细菌（如大肠杆菌、长柄芽孢杆菌、炭疽杆菌和根癌杆菌），除了含有Dps蛋白，还有铁蛋白等其他防御蛋白。铁蛋白能够在铁限制条件下发挥储存铁的重要作用，也能够辅助Dps蛋白产生H2O2胁迫抗性[138]。

4 结 语

随着食品产业的规模化发展和食品的快速流通，食源性致病菌在食品加工和贮藏相关胁迫诱导下发生交叉适应现象，从而引起表型或基因型的改变，在整个食品加工过程中得以生存，留下严重的食品安全隐患。目前，关于食源性致病菌产生交叉适应现象的分子机制研究主要围绕σ因子、TCS、SOS反应和DNA结合蛋白的性质和调控机制进行展开，但是在某些特定胁迫组合下对于致病菌存活的具体调控机制和不同系统之间的协同作用仍不明确。因此，需要进一步研究各种致病菌在多种复合环境胁迫下的亚致死情况和应激反应机制，从而达到更高效的灭菌目的。在避免/减轻交叉适应情况方面，食品加工领域需要尽量避免这些能够引起交叉适应现象的胁迫组合。在未来的研究中，可以对胁迫诱导条件下的转录调节因子、蛋白酶等在转录、蛋白质或活性水平上进行量化，使它们成为菌株抗逆性的重要生物标志物，从而帮助识别细菌短期和长期耐受性反应。这种在分子和表型水平上定量关联微生物的反应可以帮助识别致病菌在胁迫条件和特定食品贮藏加工手段下的表型行为，有助于设计和开发更有效的食品保存方法或控制策略[77]。