基于网络药理学对四君子汤干预肠梗阻解除后的代谢通路研究

郑章强，王彤彤，李 琳，许妍妍，于向阳

机械性肠梗阻（mechanical intestinal obstruction，MIO）是腹部外科常见病之一。虽然微创手术比例逐年增加，但腹、盆腔各种复杂大型手术、腹腔放疗、腹腔化疗、热灌注的开展也愈发普及，术后肠粘连的病理损害有更加复杂和严重的趋势，MIO也随之愈发常见，常伴有以肠为中心的多器官损害[1-3]。MIO绝大多数都需要手术治疗，术后多有明显的肠功能障碍及全身免疫失衡和营养障碍，中医证候也较难把握。研究发现中药四君子汤对肠梗阻解除后的这一状态具有良好的干预作用[4-5]。

中医以往主要关注单纯性肠梗阻和发病早期的肠梗阻，治则上以承气方剂为代表的通里攻下法研究较多[6]，术后的肠功能障碍的原因是“脾失运化”，沿用“通里攻下”的治则显然是不合理的。至虚，是因为MIO病在脾胃，病久邪实严重损伤正气，是正气虚甚的内在本质；盛候，是邪气有余的外在表现。MIO术后脾胃气虚，脾不膛运，水谷不化，气血生化无源，但由于脾胃运化无力，中焦转输不利，而出现脘腹胀满作痛，或脉弦等似邪气有余之盛候。MIO手术后的辨证应抓住“本”，不应被假象迷惑。

中医的“证”是疾病某一阶段病因、病理、病机、病位的宏观概括，在对疾病的整体把握上更具优势，而阐明证候实质亟需客观依据。外科危重症的中医证候与免疫网络失衡具有重要的内在联系，可以说后者是前者实质的主要部分[7]。免疫炎症基因网络极其复杂[8]，目前为止，从炎症角度的病情判断和预警方法均不理想。

以往研究表明利用四君子汤干预肠梗阻解除后的动物，证实了四君子汤促进肠黏膜机械屏障的修复及全身系统免疫功能的良好干预作用[9]。国内学者在针对免疫炎症反应平衡调节时提出“扶正祛邪”的概念，但是仍需反映证候的客观指标作为指导[7]。近年来随着基因组学、蛋白组学、代谢组学以及网络药理学的发展，新药开发的理念更加关注生物网络的整体观和炎症信号通路的调控[10-12]，这与中医提倡的整体观和中药的多靶点调理作用是相契合的。

中医证候是对机体病理状态的宏观概括，代谢组学研究内容则反映出宏观状态下机体的微观表现，近年来运用代谢组学方法对中医证候的研究取得了一定进展，用整体性思路的代谢组学与中医的整体观念进行有效结合，为中医药的研究提供了新的思路，加快中医药研究的现代化进程[13-15]。

1 材料与方法

1.1 试剂与主要设备 ALLLEGRATM-64R 高速离心机（美国Beckman），KQ-300DV型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司），Waters Acquity UPLC -Xevo G2 Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪（美国Waters），UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）（美国Waters）。色谱纯乙腈（瑞典Oceanpak）与甲酸（美国 ROE）。

1.2 药物 四君子汤原药材由天津市南开医院中药库统一途径采购。所选四君子汤（选自太平惠民和剂局方）由人参（由党参代替）、茯苓、白术、甘草按 3:3:3:2比例配伍，水煎煮40 min，滤渣，滤液浓缩为100%（生药含量为1 g/mL）药液。

1.3 实验动物 成年健康SPF级SD大鼠70只，体质量150～200 g，雌雄各半，动物许可证号SCXK(京)2014-0004，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.4 造模方法及分组 实验开始前在动物室正常饲养1周，随机将大鼠分为正常对照组10只、模型组（梗阻解除后自然恢复）30只和四君子汤干预组（梗阻解除后四君子汤干预）30只，利用课题组前期实验建立的大鼠“可复性”肠梗阻造模方法制作肠梗阻模型[16]，造模前12 h禁食，6 h禁水。麻醉、鼠板仰卧固定，腹部去毛，消毒。腹正中切开，找到末端回肠1 cm处，用眼科血管钳系膜戳孔，用经消毒的弹性软夹穿过系膜孔，并夹住肠管。还纳肠管后分层缝合腹壁，放回饲养笼，自由进食进水。梗阻72 h后，再次麻醉、手术取出弹性软夹，解除梗阻。

1.5 给药方法 模型组梗阻解除后12 h即首次中药灌胃（生药20 g/kg），每天1次，连续1周。

1.6 术后检测项目及时间 （1）大鼠一般情况观察：活动、进食、外观等。（2）大鼠血液全代谢组学分析：梗阻解除后第1、4天经大鼠眼眶静脉丛取血，第7天经门静脉取血，静置、离心、取上清，-80 ℃超低温保存待测。

1.7 液-质联用代谢组学分析 （1）血液样品的处理：采用有机溶剂乙腈，对血清样品进行沉淀蛋白的处理，高速离心，取上清液用于Q-TOF质谱分析。（2）色谱条件：流动相：A相0.1%甲酸水，B相0.1%甲酸乙腈，采用梯度洗脱，具体洗脱条件如表1；流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。（3）质谱条件：采用电喷雾电离(ESI)源，分别在正、负离子电离模式下进行质谱分析。使用高纯N2作为辅助喷雾电离与脱溶剂气体，干燥气流速为10 mL/min，N2温度设定为350 ℃，雾化气气压为310 kPa，脱溶剂N2流速600 L/h，锥孔反吹氮气50 L/h。毛细管电离电压2.1 kV，四极杆扫描范围m/z 50-1000。

1.8 数据的处理和分析 本实验采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF/MS）技术对大鼠血浆样本进行代谢组学研究，利用代谢组学MarkerLynx（美国Waters）软件，对获得的高分辨质谱数据进行背景扣除、滤噪、保留时间校正、谱峰匹配和归一化等预处理，采用PCA主成分分析和PLS-DA最小二乘法判别分析，获得对分类有较大贡献的差异性特征离子。

1.9 生物学信息的提取 采用SPSS 22.0软件对获得潜在变量进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。利用标志物的m/z值在HMDB(http://www.hmdb.ca/)数据库和KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)数据库中查找可能的物质，并通过MS/MS分析、代谢物数据库信息以及文献等信息来确认候选的生物标志物。通过MetPA富集分析(http://metpa.metabolomics.ca./MetPA/faces/Home.jsp)得到与肠梗阻相关的代谢通路。

2 结果

2.1 大鼠基本情况观察 对照组大鼠术后均精神良好并且无死亡；模型组大鼠于术后3 h左右逐渐恢复清醒；随着梗阻时间不断延长，模型组大鼠逐渐出现精神倦怠，活动减少，反应迟缓，腹部抽动及贴笼现象。随着梗阻时间延长，大鼠肠梗阻症状明显，观察过程中未见粪便颗粒，完全性肠梗阻模型造模成功。死亡率随着时间的延长也在逐渐升高，梗阻6 h、梗阻12 h未见大鼠死亡，梗阻24 h大鼠死亡率达到10%（3/30），梗阻48 h大鼠死亡率达到26.7%（8/30），梗阻72 h后死亡率达到46.7%（14/30）。四君子汤干预组梗阻6 h、梗阻12 h未见大鼠死亡，梗阻24 h大鼠死亡率达到13.3%（4/30），梗阻48 h大鼠死亡率达到 20%（6/30），梗阻72 h后死亡率达到43.3%（13/30），见表1。

表1 大鼠死亡率变化表

2.2 大鼠血浆代谢组学分析结果

2.2.1 血浆UPLC-Q-TOF/MS总离子流谱 大鼠血浆UPLC-Q-TOF/MS正、负离子模式下总离子流图见图1，大鼠血浆代谢物在正、负离子模式下均具有较好的分离效果，说明血浆样本中代谢物具有进一步分析的意义。

图1 大鼠血浆UPLC-Q-TOF/MS正、负离子模式下总离子流图

2.2.2 血浆代谢物的主成分分析（PCA）与偏最小二乘方判别分析（PLS-DA）分析 将预处理后的数据导入Simca-p 12.0软件进行PCA与PLSDA多元变量统计判别分析，考察正、负离子模式下模型组与正常对照组大鼠代谢轮廓的离散程度。得分图中代表样本的点越聚集表明样本中的代谢物越一致，即说明模型动物机体内病理或生理状态越相似。模型组和正常对照组大鼠的血浆样本点可明显区分开，且各样品点在一定范围内较紧凑，表明大鼠梗阻解除后，体内生理代谢受到严重扰动，偏离正常对照组大鼠体内代谢物分布轨迹，表明肠梗阻致脾虚证大鼠模型机体内源性代谢物方面发生了显著变化，见图2、图3。

图2 UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下模型组与正常组血浆样品PCA与PLS-DA分析得分图

图3 UPLC-Q-TOF/MS负离子模式下模型组与正常组血浆样品PCA与PLS-DA分析得分图

进一步对给药第1天正常对照组、模型组、四君子汤干预组三组样品进行PCA和PLS-DA分析，由PLS-DA图可知，三组样本点在正负离子模式下具有不同程度的分离，且各样品点在一定范围内紧凑聚集。表明肠梗阻大鼠体内生理代谢受到严重扰动，偏离正常对照组大鼠体内代谢物分布轨迹，且四君子汤组距正常组一定距离，干预作用不明显，见图4、图5。

随后对给药第4天正常对照组、模型组、四君子汤干预组三组样品进行PCA和PLS-DA分析，三组样本点在正离子模式下具有不同程度的分离，且各样品点在一定范围内紧凑聚集，并且通过PLS-DA分析可以看出，四君子汤干预组样本点不同程度地向正常对照组靠近。说明三组大鼠在体内的代谢层面上存在不同程度的差异，也揭示了四君子汤对肠梗阻大鼠体内的代谢状况产生了较为明显的干预作用，见图6、图7。

最后对给药第7天正常对照组、模型组、四君子汤干预组三组样品进行PCA和PLS-DA分析，三组样本点在正离子模式下具有不同程度的分离，且各样品点在一定范围内紧凑聚集，并且通过PLS-DA分析可以看出，第7天与第4天的变化趋势相同，即四君子汤干预组样本点不同程度地向正常对照组靠近，表明四君子汤对肠梗阻大鼠体内的代谢发挥明显的干预作用，见图8、图9。

图4 给药第1天UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

图5 给药第1天UPLC-Q-TOF/MS负离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

图6 给药第4天UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

图7 给药第4天UPLC-Q-TOF/MS负离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

图8 给药第7天UPLC-Q-TOF/MS正离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

图9 给药第7天UPLC-Q-TOF/MS负离子模式下各组血浆样品PCA和PLS-DA分析得分图

2.2.3 生物标志物的鉴定 通过多元统计分析、整合化分析以及相对含量变化分析筛选出17个与肠梗阻相关的生物标志物的m/z值。利用m/z值在HMDB 数据库中进行检索比对得到可能的内源性物质，用于进一步生物标志物的确定。以离子（tR=4.81 min，[M+H]+m/z 518.3244）为例解释化合物鉴定过程。首先在MarkerLynx V4.1 软件中预测出一个分子式为C26H48NO7P。在质谱图中，化合物的二级碎片有m/z 518.3、500.3、184.0、104.1，推测出是[M+H]+分别丢失-H2O、-C21H34O3、-C21H35O6P。通过HMDB数据库检索，最终得出该化合物为LPC(18:3)。根据生物标志物的双重筛选标准 VIP＞1.0 与 T-Test（P＜0.05），在血浆正离子模式下筛选出17个肠梗阻潜在的生物标志物，结果如表2所示。由表可知，与对照组相比，肠梗阻所致生物标志物水平发生变化，经四君子汤干预后显著回调。

表2 肠梗阻潜在生物标志物及变化趋势

2.2.4 MetPA数据库构建的血浆中肠梗阻相关代谢通路分析 为进一步分析大鼠肠梗阻的发生实质，将初步筛选的血浆中肠梗阻潜在生物标志物输入MetPA数据库(http://metpa.metabolomics.ca./MetPA/faces/Home.jsp)构建大鼠体内血浆中与肠梗阻相关的代谢通路。结果显示代谢紊乱主要与以下代谢路径：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、精氨酸及脯氨酸代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢有关，见图10。

图10 采用MetPA数据库构建的基于UPLC-Q-TOF/MS的血浆中肠梗阻相关代谢通路

3 讨论

3.1 大鼠可复性肠梗阻模型的代谢改变 肠梗阻发病后由于疾病消耗，进食受限，治疗过程中禁食水，待梗阻解除后，往往出现虚实夹杂之证，以虚为主，临床主要表现为营养不良和免疫功能紊乱，使得脾胃症状继续加重，气血亏虚，不能濡养五脏六腑，导致脾虚运化失常。因此解除梗阻后，脾胃功能失调，运化失常，故而多见脾气虚弱之证[17-19]。

本实验笔者成功复制了笔者前期实验的动物模型，并且通过采用现代代谢组学方法，分析梗阻解除后大鼠体内代谢水平，通过对比分析，发现机体内源性代谢物发生显著变化，说明大鼠脾虚模型在代谢水平即表现出显著变化。

3.2 四君子汤对肠梗阻解除后大鼠模型的干预目前研究表明，四君子汤在肠道免疫系统、肠道黏膜屏障、肠道菌群、肠道神经系统、肠道运动功能和吸收功能、肠道组织结构等方面表现出了诸多调节作用[20]，但在内源性干预机理方面尚不明确。本实验通过大鼠可复性肠梗阻模型血浆代谢组学分析发现，四君子汤干预组大鼠血浆代谢物回调作用明显，四君子汤能够改善肠梗阻解除后大鼠体内代谢紊乱情况，并且随着时间的延长改善效果愈加明显。

3.3 精氨酸和脯氨酸代谢 内源性精氨酸的合成代谢已经基本清晰，肠道中鸟氨酸转氨酶将脯氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸合成鸟氨酸，然后被鸟氨酸转氨甲酰酶作用生成瓜氨酸，而瓜氨酸被转运到肾脏后被精胺琥珀酸合成酶和精胺琥珀酸裂解酶作用后生成精氨酸。精氨酸的分解代谢在体内并非单一途径，目前研究认为主要通过精氨酸酶、精氨酸甘氨酸转氨酶、一氧化氮(NO)合成酶和精氨酸脱羧酶这几个途径分解[21]。

一般说来，精氨酸是成年人的非必需氨基酸，但在烧伤、损伤、小肠和肾脏受损等生理应激情况下，精氨酸是必不可少的[21-22]。在大多数哺乳动物中，内源性精氨酸主要是通过肠-肾轴生物合成的[23]。虽然精氨酸可以在肝脏中合成，但几乎没有精氨酸的净产量，肝细胞中的精氨酸水平远低于其他氨基酸[24]。研究表明，几乎95%的肠道来源的精氨酸和瓜氨酸绕过了猪的肝脏[25]，人类的精氨酸和瓜氨酸代谢也有类似的现象。

精氨酸是哺乳动物细胞发育所必需的，研究表明巨噬细胞在培养中需要精氨酸，另外，补充精氨酸的存在使巨噬细胞能抵抗单纯疱疹病毒的传染[26-27]。许多关于哺乳动物以及人的研究均提示精氨酸是肠道免疫反应重要的组成部分，补充精氨酸可以有效减少肠道的损伤，增加细胞的增殖[28-30]。精氨酸可以通过不同途径增强机体免疫功能，例如促进T细胞及单核细胞的增殖和释放以及促进胸腺细胞的分裂及增殖等[31]。另外，精氨酸也可以作为NO合成的前体，而NO可以作用于大多数免疫细胞，从而发挥期调节免疫的作用[32]。

肠梗阻解除后肠道机械屏障功能的恢复也是至关重要的，四君子汤有促进肠黏膜机械屏障的修复。动物实验研究表明精氨酸可以通过促进肠黏膜生长、增加小肠绒毛、维持肠道通透性、抑制细菌移位等形式提高肠道机械屏障功能[32]。

笔者研究发现模型组与对照组相比血浆中精氨酸水平明显下降，考虑为肠梗阻后肠道功能障碍导致精氨酸摄入水平下降、内源性精氨酸产生不足以及分解代谢增加，最终导致体内精氨酸水平下降，而肠梗阻解除后体内代谢并不能马上恢复到正常水平，影响机体整体免疫功能，使机体免疫功能进行性下降；在给予四君子汤干预后大鼠血浆精氨酸水平明显回调，表明四君子汤可通过影响精氨酸代谢发挥改善肠道功能障碍以及影响全身免疫的作用。

3.4 磷脂代谢 磷脂组成生物膜的主要成分，分为甘油磷脂与鞘磷脂两大类，甘油磷脂是机体含量最多的一类磷脂，磷脂对活化细胞，维持新陈代谢，基础代谢及激素的均衡分泌，增强人体的免疫力和再生力，都能发挥重大的作用[33]。另外，磷脂还具有促进脂肪代谢，防止脂肪肝，降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用[34]。它除了构成生物膜外，还是胆汁和膜表面活性物质等的成分之一，并参与细胞膜对蛋白质的识别和信号传导。

在肠梗阻解除后，机体内卵磷脂以及鞘磷脂的代谢并未恢复到正常水平，这势必影响肠道内脂类的吸收以及蛋白质的摄取，导致体内营养障碍进一步加重，四君子汤通过影响甘油磷脂代谢通路以及鞘脂代谢通路调节甘油磷脂及鞘磷脂代谢，进而改善机体内的新陈代谢并增强机体免疫力。

3.5 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸统称为支链氨基酸，支链氨基酸在正常状况下机体不能合成，需要通过外界食物才能转变为身体的有用成分，因此属于必需氨基酸范畴。支链氨基酸主要由细菌、真菌和植物合成，是人体必需氨基酸[35]，因此在动物体内是不存在生物合成通路的。本实验大鼠体内不存在此代谢通路，笔者考虑可能与其肠道菌群代谢紊乱有关，有待进一步研究。

综上所述，四君子汤能够改善肠梗阻解除后大鼠体内代谢紊乱情况，并且随着时间的延长改善效果愈加明显，进一步说明了四君子汤对肠梗阻解除后肠功能障碍、全身免疫失衡和营养障碍具有良好的干预作用。通过实验发现四君子汤的干预机制主要表现在对精氨酸代谢通路和磷脂代谢通路的影响，但其中具体作用机制尚不完全清楚，需进一步研究。