19个自育葡萄品种(系)指纹图谱构建

王 勇，孙 锋，苏来曼·艾则孜，李玉玲，伍国红，骆强伟，郭平峰

(新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所,新疆鄯善 838200)

0 引 言

【研究意义】葡萄是重要的果树树种，其栽培面积和产量位居水果第二[1]，葡萄产业在我国的果树上占有重要的位置[2]。我国葡萄种质资源丰富，国家果树种质郑州圃、山西圃、左家圃收集保存国内外野生资源、地方品种、育成品种等各类葡萄种质资源3 395份次。我国自20世纪50、60年代起至今累计培育出葡萄品种(系)200多个[3]。目前对葡萄等非主要农作物品种关注不够[4]。开展品种鉴定与谱系分析方法研究，对种苗认证、品种登记和植物新品种保护有重要意义。【前人研究进展】果树传统的种质资源的鉴定方法有形态学、孢粉学、细胞学[5]、同工酶[6]等，这些方法因受环境、品种或技术等方面的影响，不能快速、准确、有效地完成品种资源间的鉴定[5,6]。TP-M13-SSR(simple sequence repeat with tailed primer M13)技术是结合荧光测序技术与SSR标记技术开发的SSR扩增产物荧光测序检测技术，其检测结果重复性好、准确性高、且操作程序简单，是种质资源鉴定的最简单、有效的方法[7]。目前已应用在葡萄[8-10]、苹果[6,11-14]、梨[15-17]、桃[5]、樱桃[18]、枣[19,20]、杏[21]、核桃[22]等果树的指纹图谱构建和亲缘关系分析中，提高了品种资源的鉴定能力，加强了品种知识产权的保护。【本研究切入点】目前研究培育出了新郁、新雅、新葡1号、火州紫玉等多个品种(系)，其中一些品种已开展了大面积推广，但到目前为止还未曾利用分子手段开展谱系分析与品种保护方面的研究。【拟解决的关键问题】研究以自育的19个品种(系)葡萄为试材,基于TP-M13-SSR技术，构建指纹图谱，并编码建立种质分子身份证，为苗木认证、新品种登记及保护奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 葡萄品种(系)谱系

试验于2019年5～12月在新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所分子实验室和葡萄制干鲜食兼用品种改良课题实验室进行。19份葡萄品种(系)材料均取自新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所葡萄资源圃。表1

表1 19个葡萄品种(系)谱系Table 1 The genealogy of 19 grape varieties (lines)

1.1.2 引 物

选用16对SSR标记引物。其中，VVS2、SCU06、VVMD5、VVMD6、VVMD7、VVMD27、VRZAG29、VRZAG62、VRZAG79等9对引物为国际通用葡萄SSR引物[7]，VCHR15a，VCHR13a，VCHR4a，VRZAG67，VMC7H3，SCU15vv，UDV-088等7对引物为前期工作筛选出的具有较高多态性信息量(PIC)的引物。引物均由北京擎科生物技术公司合成，每对引物F序列的5’端进行FAM荧光标记修饰。表2

1.2 方 法

1.2.1 葡萄基因组DNA的提取

参照CTAB改良法[23]提取葡萄试材基因组DNA；通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的试材基因组DNA的浓度和纯度；将DNA溶液分为2份，1份放入摄氏度-20℃冰箱里长期保存，1份放入摄氏度4℃冰箱备用。

1.2.2 反应体系

使用PCR反应体系为：2×TaqMix酶10 μL，SSR双引物混合液(10 μM/mL)0.8 μL，模板(20 ng/μL)2.0 μL，dd H2O 7.2 μL，总反应体系为20 μL，PTC-100型PCR仪上进行反应。扩增程序参照王勇等[23]的方法，在操作中根据各引物差异进行体系优化。

1.2.3 PCR产物的检测

利用2%的琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行水平电泳检测，若有扩增结果不理想的，需要进行补充，由生物技术公司通过毛细管电泳检测产物片段种类和大小。

表2 16对葡萄SSR标记引物序列及其荧光标记Table 2 Sequences and labeled fluoresce of 16 SSR primers

1.3 数据处理

利用PowerMarker v3.25 软件计算等位基因个数、 基因型个数、 等位基因频率，依据所得的等位基因频率，计算各标记位点的多态性信息含量(PIC)，公式：

Pij是第i个标记位点的第j个等位基因的频率。

数据标准化处理参考陈昌文等[5]的方法。根据每对引物对不同种质扩增片段对应的分子量大小，按从小到大依次编码为 1～8。若引物扩增的某一品种有 2 个等位基因时，选择条带小的编码赋值。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA质量检测

研究表明，基因组 DNA片段完整，浓度很高，能够做模版，开展PCR扩增。图1

图1 试材基因组DNA提取电泳检测Fig. 1 Results of genomic DNA electrophoresis of the materials

2.2 PCR产物毛细管电泳

研究表明，4对引物扩出了7个多态性基因片段，4对等位基因型，其中VVS2扩增的基因为纯合等位基因，SCU06、VVMD5、VMC7H3为杂合等位基因，4对引物的2次扩增结果均存在轻微差异，试验的扩增体系和毛细管电泳结果良好。图2～5，表3

表3 4对引物对新郁重复扩增的毛细管电泳检测Table 3 The detection results of repeated amplification of Xinyu with 4 pairs of primers

图2 引物SCU06对新郁葡萄重复扩增的毛细管电泳检测图谱Fig. 2 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by SCU06 primer

图3 引物VVS2对新郁葡萄重复扩增的毛细管电泳检测图谱Fig. 3 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVS2 primer

图4 引物VVMD5对新郁葡萄重复扩增的毛细管电泳检测图谱Fig. 4 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VVMD5 primer

图5 引物VMC7H3对新郁葡萄重复扩增的毛细管电泳检测图谱Fig. 5 The detection pattern of repeated amplification of Xinyu grape by VMC7H3 primer

2.3 16对SSR标记PCR扩增

研究表明，利用16对SSR标记引物对19份葡萄种质资源进行扩增，共有69个等位位点，扩增出105个等位基因，平均每个SSR引物有6.56对等位基因，平均每个 SSR 位点有 4.31 个。扩增产物片段大小的变幅为109～252 bp，每个位点的基因型个数变幅为4(VrZAG29)～16(VRZAG67)。16 对引物中扩增出等位位点数最多的是VRZAG67，最少的是VrZAG29、SCU15vv和VCHR13a；多态性信息指数(PIC)变化范围为0.28～0.92，平均为0.72；其中引物VRZAG67的 PIC 值最高为0.92，引物 VrZAG29 的 PIC 值最低为0.28。多态性信息指数(PIC)是用来衡量 SSR 引物多态性高低的一个重要指标。按照衡量基因变异程度高低的PIC指标(>0.5 时，为高度多态性信息引物；在0.25～0.5时，为中度多态性信息引物；<0.25 时，低度多态性信息引物)，筛选出的 16 对 SSR 引物，除VrZAG29外，均为高度多态性引物。15 对SSR引物能以较高的信息量反映出葡萄品种的基因型多样性水平，可以用于遗传多样性水平分析。表4

表4 16对SSR标记引物扩增Table 4 The statistics of amplification results of 16 pairs of SSR marker primers

2.4 19个葡萄品种(系)的指纹条带

研究表明，每个品种在16个位点上均有纯合等位基因和杂合等位基因2种类型，其中新葡1号的纯合等位基因最高，12个位点为纯合等位基因，比率为75%，SP275居第2，有11个，火州紫玉第3。新雅的杂交等位基因最高，15个位点为杂交等位基因，比率为93.75%，新郁、紫霞居第2，均为14个，SP522、SP137、居第3，均为13个。VRZAG79、VVMD27 2对引物扩增条带几乎相同，可能为同一基因位点。SP4614具有3个特异等位基因(VVS2-143、SCU06-177、VVMD7-250)，SP6164、SP8028、SP10140各具有一个特异等位基因(分别为VVMD7-242、VRZAG79-182、VrZAG62-191)。表5～7

表5 19个葡萄品种(系)的指纹条带Table 5 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表6 19个葡萄品种(系)的指纹条带Table 6 The fingerprint bands of 19 grape varieties (lines)

表7 16对葡萄SSR标记引物对19个葡萄品种(系)扩增的等位基因杂合度Table 7 The statistics of allele heterozygosity of 19 grape varieties (lines) amplified by 16 pairs of SSR marker primers

2.5 构建19个自育葡萄品种(系)指纹图谱

研究表明，16对引物中扩增最多的等位基因数为8，故赋值范围为1～8。取位点小的进行分子编码，给分子身份证字符串的每位上赋予1个字符。对19份供试葡萄品种进行分子编码，用选取的 5对引物可以将19个品种(系)进行有效区分。选择多态性信息较高的引物5对，构建指纹图谱。表8～10

表8 16对葡萄SSR标记引物对19个葡萄品种(系)扩增结果Table 8 The amplification results of 19 grape varieties (lines) with 16 pairs of SSR marker primers

表9 19个葡萄品种(系)的指纹图谱Table 9 The fingerprint of 19 grape varieties (lines)

表10 SSR引物组合对葡萄品种(系)的区分Table 10 Differentiation of grape varieties (lines) by SSR primer combinations

按照引物多态性信息量(PIC)的高低顺序对品种进行区分，引物VRZAG67(PIC为0.92)能够区分SP137、SP10140 2个品系，VRZAG67+VVS2可以区分9个品种(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06仍是区分9个品种(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7可以分区13个品种(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a可以分区17个品种(系)，VRZAG67+VVS2+SCU06+VVMD7+VCHR4a+VCHR15a仍是分区17个品种(系)，最后在增加引物VVMD5才能将紫霞和新雅区别开来，这说明紫霞与新雅的亲缘关系很近。第3对引物SCU06和第6对引物VCHR15a在19个品种(系)的区分上，没有实际意义，按照最简原则，将两者去除，最终5对引物能够实现19个品种(系)的鉴别，使用5位数进行数字编码赋值。表11

表11 19个葡萄品种(系)分子身份证编码Table 11 Molecular ID code of 19 Variety (line)

3 讨 论

SSR标记是一种既具有高稳定性又具有高准确性的分子标记[24]，在果树品种资源鉴定中具有重要的应用价值。在苹果上，张春雨等[11]采用SSR分子标记构建了新疆野苹果核心种质。金万梅等[12]利用SSR标记开展了苹果矮化砧木SH系鉴定，探明了7 份SH系的“同物多名”、“异物同名”问题。高源等[6,14]利用3对TP-M13-SSR标记完成了国家果树种质兴城梨、苹果圃保存的 131 份苹果地方品种、育成品种及其野生近缘种区分，利用6对TP-M13-SSR标记完成了314份来自19个国家的苹果栽培品种的区分。在梨上，张东等[15]利用6对SSR引物对 29个砂梨品种或类型做了亲缘关系分析。高源等[16]利用SSR荧光标记构建中国建国以后选育的92个梨品种指纹图谱，为品种鉴别提供依据。鲁敏等[17]采用10对EST-SSR 引物和9个果实品质性状指标对收集的220份野生刺梨资源的遗传多样性进行了分析。在桃上，陈昌文等[5]利用8对SSR标记核心引物构建了173份中国桃主要品种资源及其野生近缘种的分子身份证。在樱桃，艾呈祥等[18]构建了24个甜樱桃主要栽培品种SSR指纹图谱数据库。在枣上，麻丽颖等[19]利用12对SSR引物构建了36份枣品种SSR指纹图谱，为枣树分类、种质鉴定和分子育种提供了重要的工具。王斯琪等[20]用SSR标记进行枣树子代自然授粉实生苗父本鉴定。在杏上，刘娟等[21]利用4对ISSR引物构建了48个新疆主栽杏品种(系)指纹图谱库。在核桃上，周贝贝等[22]采用表型性状和 SSR 标记的方法建立核桃亲子鉴定方法。在葡萄上，王慧玲等[9]利用9对国际通用SSR标记引物构建了13个中国葡萄优新品种的分子身份证。马亚茹等[10]开发了葡萄无核性状的SSR分子标记VvSD10，这将对葡萄杂种后代进行早期无核性状鉴定，为分子标记 辅助育种奠定基础。郭大龙等[8]利用SSR分子标记技术构建了48份葡萄核心种质。利用16对SSR标记引物研究了19个自育葡萄品种(系)基因型和遗传多样性，从中筛选出5对核心引物构建了指纹图谱和分子身份证。

9对国际通用SSR标记引物[7]除VRZAG29外均能在19份实验材料中表现较高的PIC值，前期筛选的7对引物也均表现出了较高的PIC值，其中VRZAG67的为0.92，高于任何国际通用SSR标记引物的。为实现利用最少引物组合，区分最多材料的目的，文中按照PIC值高低选择SSR标记引物开展19份品种材料鉴定，发现SCU06在新葡1号、紫霞、新雅、火州红玉、火州黑玉、SP522、SP122、SP8028、SP891、SP115等10份材料上不存在多态性，VCHR15a在紫霞、新雅等2份材料上不存在多态性，最终筛选出了5对SSR标记。其中VRZAG67、VCHR4a为自选引物，VVS2、VVMD7、VVMD5为国际通用引物。这说明国际通用引物不是万能的，在一些近缘品种间的高效鉴定时存在局限性。

葡萄是一种具有高度杂合性的果树树种[25]。文中16对SSR标记引物在19个品种(系)中扩增出了不同类型的基因型，出现了较高比率的杂合等位基因型，比如，新雅的为15/16、新郁和紫霞均为14/16，但也出现了一些纯合比率较高的类型，比如新葡1号为12/16、SP275为11/16，但这些基因型均表现为纯合与杂交的混合类型，这体现了葡萄的杂合特性。

4 结 论

采用16对SSR标记引物研究了19个自育葡萄品种(系)基因型和遗传多样性，从中检测出69个等位位点，105个等位基因，并认为新雅、新郁、紫霞等3个品种杂合度相对较高，新葡1号，SP275等2个品种(系)相对纯合度较高，但均为杂合类型品种(系)。

从16个SSR标记引物筛选出5对多态性信息量相对较高的引物，完成了19个品种(系)的鉴定，构建指纹图谱，并编码赋值，形成了分子身份识别码，为品种(系)间的鉴定与区分提供了依据。但由于葡萄种质共有上千余份，构建的种质分子身份证已经有5位，如果继续对更多的品种构建分子身份证，需要增加 SSR 引物数量，增加分子身份证的位数。