扁桃AcDHN1基因的克隆及原核表达分析

王 敏，李 疆，李 鹏，田 嘉，罗淑萍

(1.新疆农业科学院园艺作物研究所，乌鲁木齐 830091；2.新疆农业大学，乌鲁木齐 830052；3中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城 125100)

0 引 言

【研究意义】扁桃(AmygdaluscommunisL.)属于蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属，又被称巴旦杏，是世界四大干果之一，我国扁桃的栽培分布区主要位于新疆喀什地区的英吉沙县和莎车县及和田地区[1]。扁桃为多年生果树，一旦花期受到低温冻害时，会严重导致花蕾受冻，坐果率降低，经济受到重大损失[2]。尤其是新疆周期性的冻害天气，对扁桃的栽培产生了极大的影响。长期以来，一般都是通过优化栽培环境措施、改善栽培条件来提升扁桃的抗寒性，但是品种抗寒的遗传特性才是起决定作用的因素。通过扁桃对自身冻害的抗性机制研究，有目的性的发掘利用与其抗性相关的基因，对提高栽培扁桃的抗逆能力，促进产业的健康发展具有重要的意义。【前人研究进展】脱水素(Dehydrin)在植物中是一类胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白)，属于LEA D-Ⅱ家族,分子量大小从9到200 kD不等[3]，脱水素蛋白显著的特征是在C端或其附近含有至少一个富含赖氨酸的基序，约15个氨基酸残基(EKKGIMDKIKEKLPG)组成的K片段，K片段可以形成双亲性α-螺旋的二级结构，而α-螺旋则具有亲水性和疏水性的双重特征，是脱水素的重要功能结构，此片段在不同物种间极为保守。N端含有保守基序T/VDEYGNP组成的Y片段，与植物和细菌分子伴侣的核酸结合位点具有同源性。K片段与Y片段之间有可以被磷酸化的约6个丝氨酸串联构成的S片段。所有的脱水素不一定都含有Y和S片段，但必定都含有K片段，它是第2组LEA区分于其它组的显著特征[4-5]。脱水素的功能主要表现在植物受到环境胁迫导致细胞失水时能保持细胞内膜系统的结构稳定性，吸附多余的细胞内部游离离子，降低游离离子对植物细胞的伤害；在植物水分缺失时，与其他功能性蛋白相结合，在逆境条件下保障其他蛋白质的结构和功能不异常，保证了植物逆境条件下正常的生理代谢功能维持[6-7]。低温环境会致使膜脂的形态发生变化，膜透性增大后细胞内的可溶性物质渗漏，引起细胞死亡，是非常重要的非生物逆境之一。近几年，研究证明在低温胁迫下，植物脱水素基因的表达对植物抗寒性起正向作用。过量表达脱水素基因能增加拟南芥[8]的低温抗性，提高抗寒力；小麦[9-10]脱水素WCS120的积累量与冰冻抗性成正相关，可以区分不同冬小麦品种的冰冻抗性强弱；两种杜鹃[11]杂交后代的叶片中脱水素基因的表达与抗冻性能密切相关；香玲核桃[12]在低温诱导下，DHN快速大量表达且参与信号转导中早期基因调控；茄属[13]在低温处理下脱水素蛋白合成量增加；马铃薯[14]DHN24基因转黄瓜后可以显著提高抗低温胁迫能力；菠菜[15]中脱水素CAP85有明显的抗冻能力。【本研究切入点】但关于扁桃DHN基因与抗性相关内容尚未见报道。在经济林业研究中，克隆和分析某一功能基因可从分子水平上了解其结构，可为直接利用该功能基因打下基础[16-18]。【拟解决的关键问题】试验克隆扁桃AcDHN1基因并对其生物信息学进行分析，构建原核表达载体后在大肠杆菌进行表达，为进一步研究扁桃AcDHN1基因的分子生物学机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

将一年生栽培扁桃'纸皮'的休眠枝进行水培，等其长出3 cm长嫩叶后，置于4℃温度下胁迫处理24 h，将嫩叶收集在液氮中处理。

大肠杆菌DH5α、pET-32a(+)质粒由实验室保存，E.coliDH5α感受态细胞实验室制备。克隆载体pMD19-TVector、Pyrobest DNA Polymerasec、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶及BamHI、XhoI限制性内切酶购自TaKaRa公司。Rosetta(DE3)感受态细胞购自全式金生物公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、RNA提取试剂盒RNA plant plus reagentA、DNA Marker D15000+2000购自天根生化科技有限公司。DNA Marker D2000购于生工生物公司。引物由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

扁桃基因组RNA的提取使用天根总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagentA。cDNA第一条链合成使用Thermo试剂盒。

根据GenBank公布的全长DHN序列设计特异性引物AcDHN-F: 5'- ATGGCGCATT TTGGTTCAACACC-3'； AcDHN-R: 5'- TTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG-3'，以扁桃cDNA为模板，PCR扩增扁桃的AcDHN1基因。反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，模板cDNA 1 μL，dNTP MIX10 mmol/L、引物AcDHN-F/R(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2 μL，加ddH2O补足到25 μL。反应程序：94℃ 5 min预变性；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s反应35个循环；72℃延伸10 min。

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，并将其连接到pMD 19-T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将筛选后的阳性克隆进行测序。

1.2.2 生物信息学

将获得的扁桃AcDHN1基因在NCBI上用BLAST比对；使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)寻找最长的开放阅读框；利用BioEdit软件对氨基酸序列进行同源性分析比对；利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析编码蛋白的氨基酸序列的组成、相对分子质量大小、等电点等理化性质；使用BaCelLo在线软件(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)对扁桃AcDHN1氨基酸进行亚细胞定位分析；使用Protscale软件对AcDHN1的氨基酸序列的亲水性/疏水性预测；利用MEGA5.0软件对不同植物之间的DHN蛋白做系统发育分析。

1.2.3 原核表达载体pET-AcDHN1的构建及原核表达

根据AcDHN1编码框和原核表达载体pET-32a(+)多克隆酶切位点设计引物DHNyF: CGCGGATCCATGGCGCATTTTGGTTCAACACC;DHNyR:CCGCTCGAGTTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG。在上下游引物的5'末端分别添加BamH I、Xho I酶切位点及对应的保护碱基。以克隆好的AcDHN1甘油菌提质粒为模板，构建重组载体，用BamHI、XhoI限制性内切酶分别双酶切重组质粒DNA和pET-32a(+)原核表达载体。分别回收目的片段，T4DNA连接酶，连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，使用氨苄青霉素(Amp)抗性平板筛选重组质粒，通过PCR及双酶切检测验证。重组表达载体命名为pET-AcDHN1。

1.2.4 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将重组表达质粒pET- AcDHN1转化Rosetta(DE3)感受态细胞，将培养好的重组质粒菌液培养至OD600≈0.6，分别在不同诱导时间与不同IPTG浓度下进行诱导表达。不同诱导时间：取1.0 mL菌液于离心管中，IPTG使用浓度为0.1 mmol/L，对照pET-32a(+)空表达载体转化菌诱导0和3 h，重组蛋白分别确定0、1、2、3、4、5、6 h诱导时间，温度28℃。不同IPTG浓度：取1 mL菌液于离心管中，pET-32a(+)空表达载体转化菌加入IPTG浓度为0、0.2 mmol/L作对照，重组蛋白分别确定0、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mmol/L 6个不同IPTG浓度，温度28℃，诱导时间3 h。收集菌体后分别加50 μL dd H2O和50 μL 2×SDS-PAGE上样缓冲液用来裂解菌体，100℃条件下煮沸20 min，冷却后取8 μL样品上样，进行SDS-PAGE(5%浓缩胶和12%分离胶)电泳分析，最终凝胶使用考马斯亮蓝R-250染色并使用脱色液脱色至背景清晰。

2 结果与分析

2.1 基因的克隆与序列

扩增后获得了924 bp左右的片段。测序结果显示该基因完整的开放阅读框长度为924 bp，起始密码子ATG，终止密码子为TAA，编码308个氨基酸。图1

M：DL2000 Marker；1～4：PCR产物 ；5：阴性对照M：DL2000 Marker；1-4：PCR product ；5：Negative control图1 基因AcDHN1 PCR扩增Fig.1 PCR results of AcDHN1

2.2 生物信息学

2.2.1 氨基酸序列同源性

利用DNAMAN软件对氨基酸序列进行分析，显示AcDHN1氨基酸序列具有2类保守的特征区域，K和Y片段，属于LEA蛋白的第二家族。对扁桃AcDHN1基因的氨基酸序列进行Blastp比对及ClustalW多重比对，并将扁桃AcDHN1氨基酸序列与其他物种的DHN氨基酸进行多序列对比分析。扁桃AcDHN1氨基酸序列与其他作物DHN氨基酸序列C末端都含有K片段，但K片段含量在不同作物之间不完全一致，而且有些作物在N末端的没有Y片段。图2，图3

2.2.2 扁桃AcDHN1蛋白其他生物信息学功能

通过protparam tool软件预测扁桃AcDHN1基因编码蛋白质的相对分子质量为32.377 kD，理论等电点为5.92，分子式为C1387H2109N413O482S3，半衰期为30 h。该蛋白为稳定的亲水性蛋白。通过BaCelLo在线进行亚细胞定位分析，扁桃AcDHN1氨基酸定位在细胞核中。

▭部分为Y片段，横线部分为K片段▭This is Y segment；The horizontal line is K segment图2 扁桃AcDHN1基因编码序列和推导的氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced amino acid sequence of AcDHN1

扁桃(Amygdalus communis)AcDHN1(KT949395)；豌豆(Pisum sativum)：PsDHN1(P28639.1)；豌豆(Pisum sativum)；PsDHN2(P28640.1)；白梨(Pyrus bretschneideri)：Pb DHN(XM_009347773.1) ；碧桃(Prunus persica)：PpDHN(XM_007204276.1)；胡萝卜(Daucus carota)：DaDHN(AB105039.1)； 白梨(Pyrus bretschneideri)：PbCS120(XM_009347771.1) 梅(Prunus mume)：PmDHN3(XM_008243512.1)；枇杷(Eriobotrya japonica)：EjDHN4(KF277188.1)；苹果(Malus x domestica)：MdDHN4(JQ649459.1)；荠菜(Capsella rubella)：CrDHN(XM006281109.1)；越橘(Vaccinium corymbosum)：VcDHN(KF192819.1)Amygdalus communis：AcDHN1(KT949395)；Pisum sativum：PsDHN1(P28639.1)；Pisum sativum；PsDHN2(P28640.1)；Pyrus bretschneideri：Pb DHN(XM_009347773.1) ；Prunus persica：PpDHN(XM_007204276.1)；Daucus carota：DaDHN(AB105039.1)； Pyrus bretschneideri：PbCS120(XM_009347771.1)； Prunus mume：PmDHN3(XM_008243512.1)；Eriobotrya japonica：EjDHN4(KF277188.1)；Malus x domestica：MdDHN4(JQ649459.1)；Capsella rubella：CrDHN(XM006281109.1)；Vaccinium corymbosum：VcDHN(KF192819.1)图3 不同植物DHN氨基酸序列同源比对Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of DHN from different plants

2.2.3 扁桃AcDHN1蛋白的系统发育

研究表明，其与巴旦杏DHN氨基酸序列同源性为86.72%，碧桃60.18%，苹果55%，白梨32.79%，枇杷22%，梅26%，证明不同脱水素基因的序列之间存在较大差异，可能是不同物种的脱水素存在结构上的差异性(YSK种片段的不同组合)。图4

图4 不同植物DHN氨基酸序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino sequences of plants DHN protein

2.3 原核表达载体的构建及重组子的鉴定

使用DHNy-F/R引物对重组质粒pET-AcDHN1进行PCR检测，可扩增得到920左右的目的片段，使用BamHI和XhoI双酶切重组质粒pET-AcDHN1，可切出920 bp左右片段，pET-AcDHN1重组质粒构建正确。图5

M：DL15000 Marker；1～4 pET-AcDHN1双酶切产物；5～7：PCR产物M：DL15000 Marker；1-4 pET- -AcDHN1 double enzyme product；5-7：PCR product图5 重组质粒pET-AcDHN1的PCR及双酶切验证Fig.5 Restriction enzyme digestion and PCR analysis of pET-AcDHN1 recombinant plasmid

2.4 SDS-PAGE电泳

研究表明，重组质粒pET-AcDHN1转入Rosetta(DE3)在IPTG诱导下，预期的53 KD蛋白分子量附近有一条显著的蛋白条带，在一样的诱导条件下空载体对照并未出现此条蛋白带。在大肠杆菌中重组质粒pET-AcDHN1诱导并成功表达出了AcDHN1蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，不同浓度IPTG的诱导时，随着浓度的增高蛋白量的表达逐步的增加，浓度到0.1 mmol/L后总蛋白表达量增幅不显著(图6A)；7个不同时间的诱导条件下，蛋白量的表达先稳步增加后基本不变，推测诱导时间为3 h达到最高表达量(图6B)。不同诱导时间及不同浓度的诱导剂对重组蛋白的表达都会有一定的影响。通过对诱导条件优化，重组蛋白pET-AcDHN在诱导时间为3 h及IPTG浓度为0.1 mmol/L，出现最佳表达量。图6

M：蛋白Marker；泳道1，2为pET-32a(+)空载体IPTG 终浓度为0，0.2 mmol/L时诱导3 h；泳道3～8为pET-AcDHN1 IPTG 终浓度分别为0，0.02，0.05，0.1，0.15，0.2 mmol/L时诱导3 h

M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 3 h; line 3-8 were pET-AcDHN1 induced with 0 mmol/L, 0.02 mmol/L, 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L IPTG for 3 h

M：蛋白Marker；IPTG 终浓度为0.1 mmol/L时，泳道1，2分别为pET-32a(+)空载体诱导0 h，3 h；泳道3～9分别为pET-AcDHN1诱导0，1，2，3，4，5，6 h；M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h and 3 h, line 3-9 were pET-AcDHN1 induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, and 6 h图6 融合蛋白pET- AcDHN1在大肠杆菌中的SDS-PAGE诱导表达Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression of recombined pET- AcDHN 1 in E.coli

3 讨 论

脱水素基因是典型的逆境诱导型基因，在植物遭受逆境胁迫时产生广泛的生物学功能[5]。根据Close 等[5]的分类依据，脱水素初步分为5类，即YnSK2、Kn、KnS、SYn和Y2Kn，其中Y2Kn型则是含有二个Y片段及一到二个K片段，是一类典型的酸性的脱水素基因；Y2Kn及KnS两个类型优先易受低温诱导。例如豇豆[19]Y2Kn型的DHNI，它与种子形成过程中的抗冻相关；桃树[20]PpDHN1编码一个Y2K2型脱水素蛋白，在低温诱导时表达量增加；低温锻炼后，大麦[21]Dhn5 (Kn型) 大麦DHN8 (SKn型)的积累量与其抵御冻害能力成正相关。试验从扁桃中克隆得到脱水素基因AcDHN1，属于典型的Y2Kn型脱水素，受低温诱导调控。

脱水素是与一类与植物抗逆有关的功能蛋白，若想清楚此蛋白在冷调节途径中是如何发挥功能左右，则需要从蛋白水平上进行进一步的探究，而原核表达体系是一项完善且成熟的研究蛋白质功能和结构的基础操作[22]。研究利用新疆栽培扁桃中克隆获得AcDHN1 基因成功构建到原核表达载体pET-32a(+)中，并在大肠杆菌(ED3)中表达了得到的蛋白质分子质量为53 KD。前期通过软件预测AcDHN1蛋白分子量为32.38 kD，而在原核表达载体pET-32a(+)中TrxoTag、HisoTag和SoTag等融合标签蛋白为20.40 KD[23,24]，所以52.78 KD的融合蛋白大小与53KD电泳结果无明显出入。通过对重组蛋白的诱导条件优化，最终得到在诱导时间为3 h和0.1 mmol/L的IPTG浓度条件下AcDHN1重组蛋白其表达量最适。

SDS-PAGE检测得到，pET-32a(+)空载体表达量非常小，诱导时间增加时重组蛋白的表达量不断增高，至3 h之后表达量增高不显著。说明工程菌的表达效率并不是随着诱导时间增加表达量逐步升高，确是在3 h表达活性达到最强。推测原因伴随时间的持续，培养基中的营养物质逐渐减少，不能提供细菌的持续需求[25,26]。为了使重组蛋白高效表达，最终确定最佳的诱导时间3 h，选用最优的0.1 mmol/L IPTG进行诱导表达，IPTG浓度低条件下对诱导效果影响不大，但超高的IPTG浓度条件下致使工程菌受到毒害作用进而生长受到抑制。

4 结 论

研究克隆得到了一个脱水素基因，命名为AcDHN1，该基因全长924 bp、编码308个氨基酸的多肽，为稳定的亲水性蛋白，属于Y2Kn型酸性脱水素。通过生物信息学分析推测蛋白分子质量为32.4kD，亚细胞定位于细胞核中。同源分析结果显示，其与巴旦杏亲缘关系近DHN氨基酸序列同源性达到86.72%。构建了pET-AcDHN1重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，在大肠杆菌中成功表达了与预期长度一致大小约为52.7 kD蛋白分子量的融合蛋白。对重组蛋白的诱导条件进行优化后，确定该基因在IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导3 h表达量最佳。