三种TRACP染色法检测CIA大鼠关节切片中破骨细胞的比较

徐慧慧，刘 红，李 艳，潘静华，王少君，曹金凤，赵宏艳

破骨细胞属于组织特异性的多核巨噬细胞，来源于骨髓造血单核巨噬细胞系，在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)及其继发的骨质疏松症的发生、发展中起重要作用。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRACP)是破骨细胞分化成熟的标志物，也与破骨细胞骨吸收功能密切相关[1-2]。应用TRACP染色检测破骨细胞分化及观察破骨细胞活性是实验室常用技术之一，TRACP染色方法较多，多采用酸性磷酸酶试剂盒检测。本课题组前期进行体外培养的破骨细胞采用该试剂盒染色，破骨细胞质呈紫红色，染色清晰，染色效果理想[3]。但组织切片采用该方法则背景偏黄，对比度不高，体积较小的破骨细胞及其前体难以辨认。本实验以RA的经典模型——胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠关节石蜡切片为观察对象，采用三种TRACP染色方法分析破骨细胞的表达，以期寻找一种染色效果好、稳定性强且性价比高的染色方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1材料 正常大鼠和CIA大鼠关节石蜡切片。

1.1.2试剂 萘酚AS-MX磷酸盐、N，N-二甲基甲酰胺、快红TR盐、氯化亚锰、酒石酸钠、固红紫色LB盐、酸性磷酸酶试剂盒，均购自Sigma Aldrich公司。

1.2 方法(1)以快红TR盐为显色剂的TRACP染色方法[4]：染液配制0.1 mol/L Tris孵育液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸盐，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L快红TR盐、0.5 mmol/L氯化亚锰和25 mmol/L酒石酸钠。切片经常规方法脱蜡入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育40 min。蒸馏水洗涤3 min×3次。苏木精复染，蒸馏水冲洗3 min×3次，水溶性封片剂封片。光镜下观察，并拍照分析。(2)以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色方法[5]:孵育液配制0.1 mol/L Tris缓冲液(pH 5.0)含有1.35 mmol/L萘酚AS-MX磷酸盐，0.362 mol/L N，N-二甲基甲酰胺、3.88 mmol/L固红紫色LB盐和25 mmol/L酒石酸钠。切片经常规方法脱蜡入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育15 min。蒸馏水洗涤3 min×3次。苏木精复染，蒸馏水冲洗3 min×3次，水溶性封片剂封固。光镜下观察，并拍照分析。(3)酸性磷酸酶试剂盒的TRACP染色方法[6]：染液的配制取0.5 mL固深红GBC与0.5 mL亚硝酸钠溶液混匀，静置2 min，然后加入预热去离子水45 mL、0.5 mL萘酚AS-BI、2 mL醋酸溶液、1 mL酒石酸盐溶液。切片经常规方法脱蜡入水，浸入上述孵育液中，37 ℃避光孵育45 min。蒸馏水洗涤3 min×3次。苏木精复染，蒸馏水冲洗3 min×3次，水溶性封片剂封固。光镜下观察，并拍照分析。

2 结果

2.1 正常大鼠和CIA大鼠关节切片中破骨细胞的表达大鼠关节组织切片经TRACP染色后，破骨细胞及破骨细胞前体胞质酶活性部位可见有不溶性紫红色颗粒样沉淀。典型的破骨细胞体积较大，含有多核，形态不规则。

正常大鼠滑膜组织和骨髓组织中TRACP染色阳性的破骨细胞少见；而在CIA大鼠增生的滑膜组织中可见有大小不一、深浅不同的TRACP染色阳性的破骨细胞。此外，在CIA大鼠膝关节胫骨和股骨的骨骺及骨干的髓腔内，也可见TRACP染色阳性的破骨细胞，多位于骨小梁边缘。若关节软骨被滑膜侵蚀，则骨骺端内TRACP染色阳性的破骨细胞明显增多(图1)。

图1 正常大鼠与CIA大鼠关节破骨细胞的表达，TRACP染色：A.正常大鼠膝关节滑膜组织，蓝色箭头示软骨组织；B.CIA大鼠膝关节滑膜组织，绿色箭头示破骨细胞，黄色箭头示骨组织；C.正常大鼠膝关节骨髓组织，黄色箭头示骨组织；D.CIA大鼠膝关节骨髓组织，绿色箭头示破骨细胞，黄色箭头示骨组织

2.2 三种TRACP染色法对CIA大鼠滑膜组织中破骨细胞表达的影响采用三种TRACP法染色，CIA大鼠关节切片滑膜组织均可见TRACP染色阳性的破骨细胞，但表达强度和染色效果明显不同，其中检测效果较为理想的是以快红TR盐为显色剂和以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色方法。与酸性磷酸酶试剂盒的TRACP染色方法相比，前两种方法染色的切片背景着色浅，且可以检测较小的破骨细胞及破骨细胞前体(图2)。

图2 CIA大鼠滑膜组织中破骨细胞的表达：A.以快红TR盐为显色剂的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞；B.以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞；C.酸性磷酸酶试剂盒的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞 图3 CIA大鼠骨髓组织中破骨细胞的表达：A.以快红TR盐为显色剂的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞；B.以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞；C.酸性磷酸酶试剂盒的TRACP染色法，绿色箭头示破骨细胞

2.3 三种TRACP染色法对CIA大鼠骨髓组织中破骨细胞表达的影响经三种方法染色后，CIA大鼠关节切片骨髓组织均可见TRACP染色阳性的破骨细胞，但表达程度和染色效果明显不同。与滑膜组织切片染色结果相似，以快红TR盐为显色剂和以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色方法的检测效果更为理想；与酸性磷酸酶试剂盒的TRACP染色方法相比，前两种染色的切片背景着色淡，且可以检测到较小的破骨细胞及破骨细胞前体。快红TR盐为显色剂的TRACP法染色的灵敏度优于固红紫色LB盐为显色剂的染色法(图3)。

3 讨论

RA的主要特征是关节滑膜炎症和软骨、骨的进行性破坏，骨质破坏及由此产生的功能障碍是RA致残的主要原因。多种细胞参与该过程[7]，而破骨细胞的过度活化、增殖在RA骨破坏进程中起重要作用。研究发现RA病灶部位有大量成熟的破骨细胞及破骨细胞前体[8-9]，其过度增殖和异常活跃打破骨代谢平衡，使骨吸收占优势，从而完成了由滑膜炎症到骨质破坏的病理转变。因此，鉴定破骨细胞的分化及骨吸收功能在RA及其他代谢性骨病的研究中具有重要意义。

当破骨细胞分化成熟时，胞质中可产生大量的TRACP，因此在病理诊断中可以用TRACP染色法检测破骨细胞。TRACP染色原理：染色孵育液是以萘酚磷酸盐作为底物，以快红TR盐、固红紫色LB盐、六偶氮副品红等作为显色剂。当酒石酸钠存在酸性条件下，萘酚磷酸盐经酸性磷酸酶水解可以释放磷酸和萘酚，萘酚与显色剂偶联从而形成不溶性染料，红色染料沉积在胞质中含有TRACP的酶活性部位。

酸性磷酸酶试剂盒是实验中常用的快速检测破骨细胞的方法，我们在实验中发现对于体外诱导培养的破骨细胞采用该试剂盒染色，破骨细胞质呈紫红色，染色清晰，染色效果理想。但组织切片采用该试剂盒染色后，切片背景色偏黄，对比度差，破骨细胞轮廓不清晰，或体积较小的破骨细胞难以辨认。为提高染色效果，本实验以CIA大鼠关节石蜡切片为分析对象，观察三种TRACP法在破骨细胞中的表达差异。结果显示：三种染色方法组织切片中均可见TRACP染色阳性的破骨细胞，其中检测效果最为理想的是快红TR盐为显色剂的TRACP染色法，该方法染色背景色淡染，破骨细胞清晰，可见体积较小的破骨细胞。试剂盒染色后，切片背景色偏黄，对比度差。以固红紫色LB盐为显色剂的TRACP染色法也取得了较好的染色效果，但综合考虑实验经费(显色剂固红紫色LB盐价格明显高于快红TR盐)等原因，我们推荐以快红TR盐为显色剂的TRACP染色法用于组织切片中破骨细胞的检测。对于体外培养的破骨细胞三种染色方法均可，可根据实验自行选择。

TRACP染色时应注意染色孵育液需现用、现配，孵育液的pH值可以影响酶的活性，对染色效果影响较大，本实验采用pH 5.0的染色液取得了较好的效果。有文献报道[10]染液pH值为5.0～5.2时，染色背景常有颗粒沉渣，经蒸馏水水洗易脱片；本实验无此现象，可能与实验试剂及切片的黏附方式不同有关。此外，染色液孵育时间也需要根据样品进行调整，如小鼠样品切片可适当延长染色时间。