长链非编码RNA-RNU12在EB病毒相关胃癌中的表达及其意义

刘 芬，邹长棪，胡 丹，王晓宁，郑雄伟，苏 颖，林贤东

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)属于γ-DNA线性双链嗜淋巴细胞病毒，EBV与多种肿瘤的发生密切相关，如鼻咽癌、T细胞淋巴瘤及机会性淋巴瘤等[1]。近年EBV相关胃癌(Epstein-Barrvirus-associated gastric carcinoma, EBVaGC)已逐渐被人们认识。采用PCR、DNA原位杂交和EBER原位杂交技术检测胃癌组织中EBV相关的基因，发现EBV与某些胃癌发生、发展紧密相关[2]。2014年Cancer Genome Atlas Research Network正式将EBVaGC作为独立的亚型提出[3]。EBVaGC的发生、发展与普通胃癌有差异，但具体机制尚不清楚。lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA，参与肿瘤发生、发展、转移等各过程，具有重要的调节作用[4-6]。前期lncRNA芯片筛选及数据分析显示lncRNA RNU12在EBVaGC中特异表达[7]，但其在EBVaGC作用尚不清楚。本文旨在探讨EBV感染与胃癌的相关性，以及RNU12表达与胃癌临床病理特征、EBV感染的关系，为EBVaGC的治疗、控制和预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料选取2012年7月～2015年4月福建省肿瘤医院接受胃癌切除的113例胃腺癌患者，其中EBVaGC患者46例。患者男性89例和女性24例，中位年龄为59岁(四分位数间距：22.0～82.0岁)。肿瘤直径中位数为5.5 cm(四分位距：1.0～15.0 cm)。按第8版AJCC分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期26例，Ⅲ期64例，Ⅳ期10例；根据Lauren组织学分型：肠型77例，弥漫型36例。患者手术前未接受任何化疗。肿瘤切除后立即将一部分新鲜肿瘤组织和邻近的非肿瘤胃组织经液氮快速冷冻并于-80 ℃储存，另一部分经10%中性福尔马林中固定，并石蜡包埋。

1.2 方法113例胃癌标本采用组织芯片制作机细针打孔的方法，从众多的组织蜡块(供体蜡块)中采集数十至上百个圆柱形小组织(组织芯)，并将其整齐排列于另一空白蜡块(受体蜡块)中，制成组织芯片蜡块。

1.3 EBV原位杂交检测EBV原位杂交检测采用EBER1检测试剂盒，将组织芯片蜡块切片、烤片、脱蜡、脱水及蛋白酶K消化约5 min，滴加EBV核酸探针(Epstein-Barr encoded RNA)杂交液，55 ℃孵育90 min，37 ℃孵育过夜。一抗孵育30 min，二抗孵育20 min。洗涤擦干，滴加辣根过氧化物酶反应30 min；滴加DAB复合物显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封固。

1.4 qRT-PCR检测取100 mg的冻存新鲜组织液氮环境下研磨成粉末状，加入1 mL Trizol，静置10 min后抽提mRNA。使用分光光度计测定RNA浓度。按照逆转录试剂盒操作说明书将提取RNA逆转成cDNA，-80 ℃保存备用。实时荧光定量PCR按SyberGreen说明书配制反应体系，反应条件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s，40个循环；进行熔解曲线检测。每个样本设3个复孔，实验重复3次。以GAPDH为内参基因与各基因表达进行标准化对照，同时以T-17892癌组织表达(calibrator)对其他标本进行量化，即它的表达量设为1，量化其他样本的表达量；采用2-ΔΔCt法计算相对表达量的RQ值，为了便于统计，把RQ值取log10进行分析[8]。RNU12上游引物：5′-TGACGCCCGAA TCCTCAC-3′；下游引物：5′-ATCGCAACTCCCAGGCA TC-3′；GAPDH上游引物：5′-CCAGAACATCATCCCT GCCT-3′，下游引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

2 结果

2.1 EBV感染与胃癌临床病理特征的关系EBV原位杂交结果显示，113例胃腺癌中，46例EBER阳性，细胞核呈棕褐色。EBVaGC多表现为溃疡型或凹陷型肿物，具有淋巴上皮瘤样组织学、中低分化腺癌伴大量淋巴细胞浸润等形态学特点(图1)。EBV感染与患者年龄、分化程度、Lauren分型及肿瘤大小相关(P<0.05，表1)；与患者性别、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、脉管癌栓及神经侵犯无关(P>0.05，表1)。

图1 胃癌的EBER原位杂交：A.EBVaGC中EBER呈阳性；B.非EBVaGC中EBER呈阴性

表1 EBV感染与胃癌临床病理特征的关系

2.2 胃癌、癌旁组织中RNU12的表达利用qRT-PCR检测113例胃癌及癌旁组织中RNU12的表达水平，胃癌组织中RNU12的表达量为(0.01±0.004)(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相应癌旁组织的表达量为(0.179±0.001)，下调3.35倍，差异有统计学意义(P=0.001，图2)；表明RNU12在胃癌组织中的表达水平低于癌旁组织。

图2 qRT-PCR法检测RNU12 在胃癌及癌旁组织中的表达：红线表示每组的平均值

2.3 胃癌中RNU12表达与临床病理特征的关系根据胃癌淋巴结转移情况分为转移组和无转移组，淋巴结无转移组30例，RNU12的平均表达量0.167；淋巴结转移组83例，平均表达量为-0.061，差异有统计学意义(P=0.011)。按照EBV原位杂交检测分为EBVaGC和EBV阴性胃癌，EBVaGC组46例，RNU12的平均表达量0.108；EBV阴性胃癌组67例，平均表达量为-0.075，差异有统计学意义(P=0.025)，表明EBV感染影响RNU12表达。RNU12表达与患者性别、年龄，肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度、分化程度、Lauren分型、神经侵犯、脉管侵犯及TNM分期无明显相关性(P>0.05，表2)。

表2 胃癌中RNU12表达与临床病理特征的关系

2.4 EBVaGC及癌旁组织中RNU12的表达通过EBER检测分析，113例胃癌患者中有46例为EBVaGC。46例EBVaGC中RNU12的表达量为(0.130±0.090)(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，而相应癌旁组织的表达量为(0.393±0.093)，下调3.0倍，差异有统计学意义(P=0.023，图3)，提示RNU12在EBVaGC组织中的表达水平低于癌旁组织。

图3 qRT-PCR法检测RNU12在EBVaGC及癌旁组织中的表达：红线表示每组的平均值

2.5 EBVaGC中RNU12 mRNA表达与临床病理特征的关系将EBVaGC按照WHO(2018) 胃肿瘤组织学进行分类，TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期12例，RNU12的平均表达量为0.392；Ⅲ+Ⅳ期34例，平均表达量为0.008，两者间差异有统计学意义(P<0.05)。按淋巴结转移分组：淋巴结无转移组11例，RNU12的平均表达量0.535；淋巴结转移组35例，平均表达量为-0.026，两者间差异有统计学意义(P=0.006)。按浸润深度：0.05，表3)。

表3 EBVaGC中RNU12表达与临床病理特征的关系

2.6 RNU12表达与预后的关系46例EBVaGC组织中RNU12的相对表达量lgRQ符合正态分布，故取中位数0.074将其分为高表达组(24/78)和低表达组(22/78)。RNU12高表达组24例，死亡5例(20.8%)，平均生存时间(64±26.0)个月；RNU12低表达组22例，死亡13例(59.1%)，平均生存时间(39.9±6.8)个月。采用Kaplan-Meier分析法绘制生存曲线，结果显示RNU12高表达组总生存率高于低表达组(P=0.008，图4)。

图4 胃癌患者预后生存分析

3 讨论

EBV属于疱疹病毒具有长约184 kb的双链DNA结构，内编码大于85个基因组。EBV与其他疱疹病毒类似，有一个环形蛋白核心，外面由双链DNA包绕。EBV感染人体后可引起体液免疫和细胞免疫，却能够逃避机体的免疫监视和攻击的机制及其致癌特征[9]。EBV是第一个被发现与人类肿瘤发生有明确联系的病毒，长期感染可引起鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤[10]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子[1]。EBVaGC约占胃癌的10%，预计每年新增的EBVaGC有80 000多例[2]。2014年Cancer Genome Atlas Research Network[3]对295例胃癌的综合性分子分析及数据整合研究，提出新的胃癌分子分型方法，将胃癌分为4个亚型：EBVaGC、微卫星不稳定型、基因组稳定型、染色体不稳定型，正式将EBVaGC归为独立的亚型。本实验显示EBV感染与患者年龄、组织分化、Lauren’s分型、肿瘤直径密切相关。研究表明，EBVaGC具有独特的生物学行为，包括PIK3-CA通路突变、DNA超甲基化、PD-L1和PD-L2基因拷贝数增加等分子特征[3]。以上结果提示，EBV可能在胃癌发生、发展中扮演重要角色。

lncRNA指长度在200个核苷酸以上且不能编码蛋白质的RNA。lncRNA是近年研究热点，作为关键调控分子参与基因调控，涉及表观遗传、转录及转录后，主要作为信号分子(signal)、诱饵分子(decay)、引导分子(guide)、支架分子(scaffold)在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[11]。lncRNA与胃癌的研究也备受关注，在胃癌中发现lncRNA LEIGC在癌组织中的表达量低于癌旁和正常组织，过表达LEIGC通过上调E-cadherin，下调vimentin及EMT相关转录因子进一步抑制EMT过程，从而抑制胃癌细胞的侵袭转移能力[12]。lncRNA PVT1与FOXM1相互作用，促进胃癌细胞的增殖和侵袭，可能成为胃癌的预后标志物及药物治疗靶点[13]。本实验表明RNU12在胃癌组织与癌旁组织中表达水平有显著差异(P<0.05)，且其异常表达与淋巴结转移及EBV感染密切相关，进一步证明lncRNA异常表达在胃癌的发生、发展中起重要作用。

EBV调控的宿主lncRNA在上皮性癌中发挥重要作用[14]。几乎所有鼻咽癌患者中均发现持久性潜伏EBV感染。Li等[15]通过NGS测序技术分析7例鼻咽癌组织和7例正常鼻咽组织的lncRNA表达，结果显示：2 192个lncRNA异常表达，且涉及EBV感染相关的62个lncRNA反式调控基因。LINC00312也称为鼻咽癌相关基因7，具有抑癌基因的作用。LINC00312与鼻咽癌中由EBV转录的非编码RNA EBER-1呈高度负相关。LINC00312可以限制鼻咽癌细胞的增殖，并阻止其在细胞周期中从G1期发展到S期，从而加剧细胞凋亡。LINC00312的表达与鼻咽癌的淋巴结转移呈负相关[16]。以上结果表明，EBV调控的宿主lncRNA在鼻咽癌中起重要作用。Wang等[17]在EBVaGC研究中也发现，EBV感染可导致宿主lncRNA表达失控。本课题组前期分析表明，小核仁RNA宿主基因8(small nucleolar RNA host gene 8, SNHG8)在EBVaGC的表达明显高于在非癌性胃黏膜细胞或EBV阴性胃癌组织中的表达。EBVaGC中SNHG8的表达与TNM分期显著相关[7]。进一步研究表明，SNHG8与EBV基因相互作用，包括BHLF1、LF3、BHRF1和BNLF2a。Huang等[7]推测SNHG8可以调节TRIM28、EIF4A2、NAP1L1、PLD3、RPL18A和TRPM7的表达，可能对胃癌的发生有直接影响。RNU12是本课题组筛选的另一个与EBVaGC相关的长链非编码RNA。

RNU12在疾病及肿瘤中作用仅有少量文献报道。RNU12基因突变引起早发性小脑共济失调[18]。肝癌中研究发现RNU12可在转录水平上调控HSP72表达，进而抑制重组人TRAIL蛋白诱导的肝癌细胞凋亡。本组在前期工作和分析的基础上，重点探讨RNU12在EBVaGC中的作用。EBVaGC中RNU12在癌与癌旁组织表达差异有显著性(P<0.05)，且RNU12异常表达与TNM分期、淋巴结转移及浸润深度密切相关。Kaplan-Meier分析RNU12表达与EBVaGC患者预后，结果显示：RNU12低表达组患者总生存率比高表达组患者预后差(P=0.008)。以上结果表明，RNU12在EBVaGC发生、发展中起重要作用，可能是独立的预后指标。

综上所述，RNU12的表达水平与EBVaGC临床病理特征及预后密切相关。EBVaGC是胃癌的特殊类型，其形态学特征及基因变化与其他类型的胃癌有差异，目前相关分析仍较少。本课题组将积累更多病例进行功能和机制分析，明确RNU12在EBVaGC的作用，为治疗、控制和预防EBVaGC提供参考。