江西省首例Rh 基因镶嵌体血清学特点及分子生物学的研究

王长奇，王康，刘莎，桂红云，龚晨辉，饶美英*，高宏军，邓小兵，吴怡，陈园

(1.江西嘉佑曙光骨科医院，南昌 330003；2.南昌大学第二附属医院，南昌 330006；3.江苏力博医药生物技术股份有限公司，无锡 214400）

个体中可能同时存在两个或两个以上不同细胞系的现象。 如果细胞系来源于一个合子，通常称之为镶嵌体（Mosaic）；如果细胞系来源于两个或者两个以上合子，则称之为嵌合体（Chimera），音译为“开米拉”。 Anderson 于 1951 年研究了牛的嵌合体，描述了这两种不同情况[1]。 后来，又有学者建议对其进行区分，以便明确这两种现象不同的起源、频率和对组织的影响等[2]。 目前已经发现的血型嵌合体和镶嵌体的现象比较少见，其中，镶嵌体主要由染色体畸变和基因突变产生； 而嵌合体主要是由于双生子之间的血管交叉吻合， 造血细胞通过吻合的血管交换而产生[3]。 笔者在进行Rh 血型检查中发现1 例DC 双相，经血清学检查和基因分析证实为Rh 基因镶嵌体，这是我省首次发现，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 患者，男，19 岁，南昌人，由于手外伤而入院。实验室进行了ABO 常规血型、Rh 亚型、血常规、尿常规、凝血常规、生化等检查。

1.2 主要试剂和仪器设备 试剂：Rh 血型分型检测卡由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供，批号：201911005；抗人球蛋白检测卡由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供， 批号：201908001；ABO、RhD 血型抗原检测卡由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供， 批号：201910007；人类红细胞RhD 基因分型试剂盒(荧光 PCR 法)，批号:20200605；人类红细胞 RhCE 基因分型试剂盒(荧光 PCR 法)，批号:20200727；RhD外显子（科研）测序试剂盒（批号：20200317）由江苏中济万泰生物医药有限公司提供。所有试剂均在有效期内且按说明书进行操作，室内质控符合要求。

1.3 检测方法

1.3.1 血清学试验 采集先证者及其父母的外周血样本检查。 Rh 血型分型检测，抗人球蛋白检测，不规则抗体筛查，ABO、RhD 血型抗原检测均由江苏力博医药生物技术股份有限公司提供的微柱凝胶卡进行鉴定。

1.3.2 毛细管分离技术 ⑴用盐水洗涤红细胞3次，末次洗涤后900-1000g 离心5-15min，在保留白膜层的情况下尽可能去掉上清，混匀(离心血样，吸取白膜层附近的红细胞,洗涤后混匀)。 ⑵毛细管内加入混匀的洗涤红细胞，橡皮泥封死管底。 ⑶毛细管离心机离心20-25min。 ⑷在近心端处切取3-5mm，将红细胞冲到干净试管，盐水洗涤，配置相应的浓度进行测试。

1.3.3 Rh 基因分型 RhD 外显子（科研）测序，人类红细胞RhD 基因分型试剂盒(荧光PCR 法)，人类红细胞RhCE 基因分型试剂盒(荧光PCR 法）按照试剂盒操作说明书提取基因组DNA 进行Rh 基因分型。 该工作由江苏中济万泰生物医药有限公司完成。

2 结果

2.1 先症者血常规，尿常规，凝血常规，生化等检查:结果均在参考范围那内。

2.2 RhD 血型抗原检测 RhD 血型抗原检测中发现，血液中有2 种血型的红细胞，外观出现混合凝集现象，见图1。

图1 低倍镜下部分凝集的红细胞

2.3 先症者和其父母ABO 血型和 Rh 血型检查发现先症者血型为“O”，Rh 血型检查为D 双相，父母 ABO 血型都是 B 型，Rh 血型检查 D 为阳性。 检查结果见图2 和图3。

图2 先症者ABO 血型

2.4 先症者Rh 分型检查 结果先症者C 双相和D双相为双相， 基因型有可能为 CcDee、Ccdee、ccDee、ccdee，有待基因检测进行鉴定。 图 4 和图 5分别给出了Rh 分型检查结果和洗涤后Rh 分型检查结果。

2.5 先症者其父母Rh 分型检查：结果先症者其父亲Rh 分型检查为CCDee， 先症者其母亲Rh 分型检查为ccDEe。 两者的检查结果分别见图6 和图7。

图3 先症者父母ABO 血型

图4 先症者Rh 分型

图5 先症者洗涤后Rh 分型

图6 先症者父亲Rh 分型

2.6 先症者不规则抗体测定 先症者不规则抗体测定结果均为阴性，测定结果见图8。

图7 先症者母亲Rh 分型

图8 先症者（右边三个）不规则抗体测定

2.7 先症者毛细管离心法检查 结果先症者C 双相 D 双相为双相，Rh 基因型有可能为 CcDee、Ccdee、ccDee、ccdee，有待基因检测进行鉴定。 图 9给出了毛细管离心法检查结果。

图9 先症者毛细管离心法检查近端结果

2.8 先症者用抗D 血清分离后检查： 先症者用抗D 血清分离后分型检查大D 大C 均为阴性。 检查结果见图10。

图10 用抗D 血清分离后分型检查结果

表1 先症者及其父母Rh 基因分型

2.9 先症者核酸检测分析 ⑴临床血清学先证者可见D,C 双群，怀疑嵌合。 其父母血清学检测结果与基因分型结果相符， 根据其父母血清学结果推断该患者有可能是镶嵌体：ccdee+CcDee。⑵以基因测序方法进行分析没有发现突变，故改选方案，使用荧光PCR 定量分析。 ⑶荧光PCR 定量分析：根据血清学推断， 选择以RhD 第十外显子以及C 的特征突变点为目标，结果以CT 值表示，CT 值为达到一定荧光量所需的循环数， 在固定基因组DNA的情况下，可测定出其基因组DNA 内该型别基因含量。 （见表 2)

表2 其基因组DNA 内该型别基因含量

综合上述检查证实为该先证者为CcDee+ccdee 嵌合。

2.10 先症者两代Rh 血型家系图见图11。

图11 先症者两代血型家系图

3 讨论

本研究中的先证者外表正常， 分娩时并无双胞胎，无输血史和干细胞移植史，可以排除天然和人工开米拉。 其父母ABO 血型正反定型相符，Rh血型分析分别为CCDee 和ccDEe， 因此怀疑为罕见的Rh 镶嵌体。 通过研究发现，Rh 血型鉴定有混合现象，可能先证者体内含有2 种细胞象，也就是发育期的镶嵌体现象。先症者参加过献血，都以Rh阳性血输给了患者，如果患者自身需要输血，也可以用Rh 阳性血输给自己，此基因型可能不会引起输血反应。

关于嵌合体血型的研究较多,有报道称嵌合体血型能引起严重的输血反应。 有1 例61 岁患者因右肾癌细胞切除术后高血压,Hb 降低, 输入量为281ml 的O 型的红细胞几小时后发生严重的溶血[4]， 其原因是嵌合体现象常常导致ABO 表现型遗传上的不相符[5]。 在中国台湾发现1 例21 岁大学生的血清学血型为AB,但她的父亲、母亲却分别为BO1 型和A102O02 型， 通过单体型基因的HLAABC,HLA-DR-B,16 个 STR 位点以及 2 个 X 染色体,6 个Y 染色体STR 位点的检测分析, 该个体为A102O02/B101O02 开米拉血型[6]。 可见 Rh 嵌合体会导致Rh 表现型遗传上的不相符，在临床上应引起高度重视。 同样镶嵌体血型也有一些实例，通过研究发现, 后天RhD 镶嵌体可能是骨髓及外骨髓增殖疾病（myeloproliferative disease,MPL）的信号[7]。这种镶嵌体可能与白血病和骨髓增生异常综合征有关，它会引起缺乏肿瘤抑制基因的缺乏，使得受影响器官的恶性转化[8]。 此时需加强对患者血液病的筛查，有助于骨髓肿瘤的诊断和预测。

Rh 血型实验是输血医学中仅次于ABO 系统的第二大血型系统，Rh 血型系统抗原有D 和C、c、E、e 五种， 分别由 RhD 基因和 RhCE 基因编码组成，RhD 和RhCE 蛋白均是反复跨膜的蛋白质，Rh血型表型的多态性由基因基础即RHD 和RHCE基因突变所决定[9,10]。 使用相应的抗D、抗C、抗c、抗E 和抗e 五种血型试剂可以鉴定这些抗原，临床上D 抗原是Rh 抗原中免疫原性最强的抗原，也是最具有临床意义的抗原。 目前也发现抗E、抗C抗原引起溶血的报道[11,12]。 由于患者D 抗原出现了双相，C 抗原也出现双相， 采用高分辨率荧光对样本进行Rh 基因分型。 根据上述检测结果，先证者RhD 外显子10 的CT 值约为其父的一半， 其母的测量值则介于先证者与其父之间， 推测其存在镶嵌体；RhCE 分型结果可见先证者存在Cc，且C 的CT 值为 c 的 1/2，推测其镶嵌体组合为 Cc+cc。 先证者父亲存在一股RhD-RhCE 杂合， 另一股为正常D，其表现型为CCDee；其母亲为一股RhD 全缺失，一股正常D，其表现型为ccDEe；先证者带有两群细胞, 一群细胞表现型为CcDee， 另一群为ccdee。 先证者基因型鉴定为 CcDee/ccdee。 病人遗传关系可清楚归纳于家系图中。

目前， 国内外有一些关于临床上比较常见的嵌合体和镶嵌体的研究， 这些工作对可能的疾病有一定的启示，并且优化了部分疾病的治疗方案。本例患者RH 镶嵌体的研究对科学合理用血、更为精准的临床诊断和治疗有很大指导意义。