急性髓系白血病中垂体肿瘤转化基因-1 的表达及临床意义＊

刘婷婷 ，刘海芸 ，邹燕 ，方全钢 ，丁伟荣 ,2，柯波 ,2，朱青秀

（1.江西省人民医院血液内科，南昌 330006；2.江西省血液肿瘤细胞生物学重点实验室，南昌 330006；3.江西省人民医院检验科，南昌 330006）

急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）是一种根据形态学、细胞遗传学和分子生物学特征具有多种亚型分类的恶性血液肿瘤，此类疾病遗传背景复杂，具有高度异质性，主要表现为骨髓异常造血，并且倾向于老年患者（超过60%的患者年龄＞60 岁）[1]，因此在临床诊疗中需要结合患者的遗传学特点给予分层个体化治疗。

垂体肿瘤转化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年应用PCR 技术从大鼠垂体肿瘤细胞中首次扩增，并发现其在正常垂体细胞中表达为阴性[2]。 随后研究发现PTTG1 为一种保全素抑制姐妹染色单体分离并在多种肿瘤细胞和恶性血液肿瘤中呈高丰度水平表达， 在正常组织细胞和血细胞中表达水平非常低， 因此可作为分子靶标用于靶向治疗[3,4]。PTTG1 作为一种致癌转录因子， 可参与多种生物学进程，例如有丝分裂、DNA 损伤修复、基因调控、器官发育和代谢[5-9]。 尽管在实体肿瘤中PTTG1 基因的表达与临床意义已经得到了广泛的研究，但是在恶性血液肿瘤鲜有报道，PTTG1 在AML 中表达情况以及其与临床的相关性， 国内尚未见文献报道。本研究通过荧光定量PCR 检测初治AML 和非恶性血液肿瘤对照组以及复发AML 组中PTTG1 基因的表达水平， 分析其与临床指标的相关性，以期为AML 的分层治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 骨髓标本收集于2017 年9 月至2019 年12 月就诊于江西省人民医院血液内科27例初次诊断为AML 患者，11 例AML 复发患者，中位年龄 56.5 岁,其中男 21 例，女 17 例；纳入行骨髓穿刺检查的非血液系统肿瘤疾病患者24 例 (对照组)，中位年龄 49.5 岁，男 13 例，女 11 例。 AML组与对照组患者年龄、 性别比较差异无统计学意义( P＞0.05) 。

1.2 主要实验材料 RNA 提取试剂盒（北京天根）、QuantiNova SYBR Green PCR Kit （德国 Qiagen 公司），Quant cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根），PCR 八联管、1.5ml 离心管和 PCR 管（无锡 NEST）,荧光定量PCR 仪（天隆TL988），低温离心机（安徽中科）。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA 提取 用 EDTA 抗凝管收集骨髓血2ml，运送至实验室后加入红细胞裂解液，离心后用PBS 清洗后加入1ml RNA 提取试剂，充分混匀后加入200μl 三氯甲烷, 混匀后4℃高速离心15 min； 小心吸取上清液500μl， 并加入等体积异丙醇，混匀后静置10min；4℃高速离心15min，去上清液，并加入75%乙醇清洗；离心后去上清，待残余乙醇挥发后加入 RNase-Free 水溶解RNA 沉淀，核酸蛋白测定仪检测溶液中RNA 浓度和纯度，OD260/OD280 比值处于1.6-2.1 之间的标本进行下一步逆转录反应。

1.3.2 cDNA 合成 根据Quant cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行， 取1μg RNA 溶液， 加入 5×gDNA buffer， 共 10μl 于普通 PCR 仪中 42℃反应3min； 分别加入 FQ-RT primer、Fast-RT Buffer 和RT Enzyme Mix，共 20 μl 于普通 PCR 仪中 42℃反应 20min，85℃反应 3min。 反应结束后加入 60 μl RNase-Free 水对cDNA 进行稀释。

1.3.3 荧光定量PCR 通过Primer 3 软件设计扩增引物，PTTG1 引物序列： 上游:5’-GTGGTTGCTAA GGATGGGCT-3’，下游:5’-TTGTTTGAGGGGTCCC TTGG-3’；β-catin 引物序列：上游：5’-GCACTCTT CCAGCCTTCCTT-3’，下游：5’-AGGTCTTTGCGGA TGTCCA-3’。 最后根据 QuantiNova SYBR Green PCR Kit 说明书配置反应液，每管加入3 μl 稀释的cDNA 溶液，按说明书设置扩增程序并进行荧光定量PCR 扩增，得出扩增曲线和溶解曲线。 采用 2-△△Ct计算 PTTG1 基因的相对定量表达水平。

1.4 统计学方法 数据采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间的差异比较采用非配对t 检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PTTG1 在AML 患者骨髓细胞中的表达 荧光定量PCR 分析AML 组、正常对照组和复发组患者骨髓中PTTG1 基因的表达水平，AML 组中的表达水平明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 复发组中 PTTG1 的表达水平低于 AML 组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。 结果见表 1。

表1 PTTG1 基因在不同组别患者中表达水平

2.2 PTTG1 基因的表达与AML 患者临床特征的关系 研究结果显示，大于60 岁AML 患者中PTTG1的表达水平高于小于60 岁的AML 患者， 但是差异无统计学意义（P＞0.05）;不同性别之间 PTTG1 的表达水平无明显差异（P＞0.05）；根据初治 AML 和复发AML 患者的FAB 诊断分型， 分析PTTG1 的表达水平，结果显示M2 型AML 中表达水平最高，M1 型中表达最低，但是两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；根据《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病） 中国诊疗指南 2017 年版》对AML 患者进行危险程度分层[10]，分析PTTG1 的表达水平，结果显示，低危组中PTTG1 的表达水平最高，高危组中PTTG1 的表达水平最低，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。 结果见表 2。

表2 PTTG1 基因表达的临床相关性

2.3 PTTG1 基因的表达与AML 患者外周血血细胞计数和骨髓幼稚细胞比例的关系 通过分析AML患者外周血血常规以及骨髓涂片， 对血细胞进行分类计数，分析其与PTTG1 的表达水平的关系。研究 结 果 显 示 ，WBC ≥50×109/L 的 AML 患 者 中PTTG1 的表达水平高于 WBC＜50×109/L 的 AML 患者，但是差异不具有统计学意义（P＞0.05）；根据血常规中血红蛋白浓度判定患者的贫血程度， 分析发现重度贫血和中度贫血AML 患者中PTTG1 的表达水平明显低于轻度贫血和正常AML 患者，差异有统计学意义（P＜0.05）;根据血小板计数分为不同组别， 其PTTG1 的表达水平无明显差异 （P＞0.05）；根据骨髓涂片中幼稚细胞比例，分为0%-50%和50%-100%两组， 结果显示0%-50%组AML 患者中PTTG1 的表达水平高于50%-100%组， 但是差异不具有统计学意义（P＞0.05）。 结果见表3。

表3 PTTG1 基因表达的外周血血细胞计数的关系

3 讨论

垂体肿瘤转化基因-1 （Pituitary Tumor Transforming Gene 1，PTTG1），是 Pei 于 1997 年从大鼠垂体肿瘤细胞中首次扩增[2]。ChIP 实验也证实了PTTG1 作为一种转录因子具有转录活性， 其可以直接或者间接诱导与肿瘤形成和发展相关基因的表达，PTTG1 与c-Myc 基因的启动子相结合并诱导表达[11]，除此之外，PTTG1 还通过诱导 bFGF、VEGF 和MMP2 基因的表达从而参与肿瘤的发生发展[12-14]。 PTTG1 除了通过与靶基因的启动子结合参与细胞调节之外， 还可以与细胞内调节蛋白结合参与细胞活动的调节，PTTG1 可以通过与p53、Sp1、USF1 和PBF 等蛋白相合作用来参与基因的转录调节[15]。

有学者对肾上腺皮质癌的临床研究表明，PTTG1 基因过表达组患者的中位生存期为1.8 年，而PTTG1 低表达组患者的中位生存期为9.0 年，结果提示PTTG1 的表达水平与疾病的预后相关并可以作为预后评估的分子标志物和治疗靶标[16]。在胃癌的研究中发现， 在胃癌组织和细胞株中PTTG1 的表达明显较正常胃粘膜高， 通过对PTTG1 基因的mRNA 和蛋白表达水平进行多因素Cox 回归分析显示其表达水平可以作为胃癌的独立的预后因素[17]。 在血液肿瘤的研究中发现在36-70%的多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者中PTTG1 基因过表达， 这部分患者中与增值相关基因也呈上调表达趋势（CCNB1、CCNB2、CDK1、AURKA、BIRC5 和 DEPDC1） 并且与患者预后相关，敲除5TGM1 细胞中PTTG1 基因后明显抑制细胞增殖， 体内实验结果显示明显抑制MM 荷瘤的发展[18]。 然而，PTTG1 基因的表达调控在白血病的临床研究和实验研究中鲜有报答。 在对PTTG1 基因缺陷的小鼠的研究发现该小鼠具有血小板减少和骨髓间充质干细胞增生低下的现象[19]，还有研究发现佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)通过诱导PKC/ERK/KLF6 信号通路活化，KLF6 通过与PTTG1 基因启动子结合抑制其转录， 从而促进 HL60 细胞和 THP1 细胞分化[20]。

尽管多数研究证实PTTG1 基因在恶性肿瘤和血液肿瘤中呈高表达，但是PTTG1 基因在AML 中的表达及临床相关性尚未见报道。 白血病是一种源于分子遗传学改变导致造血系统中原始造血细胞出现恶性增生伴随分化阻滞的恶性疾病， 且具有高度的异质性。 以上文献报道提示，PTTG1 基因的异常表达可能影响血细胞的分化以及生物学功能。 本研究结果显示初治AML 和复发AML 中PTTG1 基因的表达水平明显高于对照组， 而且初治AML 和复发AML 中表达无统计学差异。 但是PTTG1 基因在AML 的发生发展过程以及对疾病预后和危险分层的作用尚未阐明。 本研究也通过分析PTTG1 基因在不同FAB 分型以及临床危险分层的AML 中的表达，结果显示不同FAB 分型和危险程度的AML 患者之间PTTG1 基因的表达并不存在统计学差异； 但是纳入本研究的临床病例较少，可能对分析结果产生一定的影响。 本研究还分析了不同血细胞计数和骨髓幼稚细胞比例的患者之间的PTTG1 基因的表达差异， 结果显示不同白细胞和血小板计数以及幼稚细胞比例患者之间PTTG1 的表达无统计学差异， 重度贫血和中度贫血AML 患者中PTTG1 的表达水平明显低于轻度贫血和无贫血的AML 患者。有文献报道PTTG1 可参与白血病HL60 细胞和THP1 细胞分化[20],然而，是否通过参与红细胞的成熟与分化调控影响AML患者的贫血状况，国内外尚未见相关文献报道，有待通过扩大样本量进一步的研究。 本课题组前期研究表明NF-κB 阳性表达AML 患者预后较差，是影响AML 患者预后的生物学指标之一[21]。 本研究下一步将研究确定PTTG1 的表达与AML 预后的临床相关性。

综上所述，PTTG1 基因在AML 患者中表达水平高于非恶性血液肿瘤患者， 提示其可能参与AML 疾病的发生发展过程，PTTG1 基因的表达水平可能影响AML 患者的贫血状况。