火鸡组织滴虫荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用

陈乔光，孔令明，戎 杰，候照峰，刘丹丹，陶建平，许金俊*

（1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009）

组织滴虫病（Histomonas meleagridis）是由火鸡组织滴虫感染禽类后引起的一种寄生虫病，又称黑头病或盲肠肝炎[1]，是对养殖业造成严重危害的一种疾病[2]。目前，该病在散养鸡、特种禽类及动物园禽类中较为常见。组织滴虫病在临床上主要引起盲肠炎、肝炎、腹膜炎[3]，感染后首先出现盲肠壁的增厚和充血，随病程发展，肝脏出现肿大，表面有大量火山口样坏死灶[4]，该病发病率较高，死亡率可达20%～30%[5]，造成的经济损失严重。

临床上对组织滴虫病的诊断仍然主要依靠剖检、显微镜刮片镜检、虫体的体外分离培养[6]等方法。由于肝脏和盲肠的病变与弧菌性肝炎、球虫病等禽病类似，且病原形态也不易与四毛滴虫等原虫区分，体外分离培养不易实现，给该病的诊断带来了一定的困难。目前国内外已经建立了多种检测火鸡组织滴虫的方法。Hafez 等建立了火鸡组织滴虫荧光定量PCR 检测方法，敏感性较高，但未进行临床样品的检测试验[7]；Meike 等建立了火鸡组织滴虫原位杂交检测方法，特异性较强，但成本较高[8]；曲昌宝等建立了鸡组织滴虫病PCR 诊断方法，特异性较强，但敏感性较低[5]。本研究以火鸡组织滴虫高度保守的18S rRNA 基因序列作为靶标，建立了火鸡组织滴虫荧光定量PCR 检测方法，并对采集的临床样品进行检测，以期为临床组织滴虫病流行病学调查提供一种敏感、特异、重复性好、可操作性强的诊断技术。

1 材料与方法

1.1 虫株、菌株和临床样品鸡源火鸡组织滴虫标准虫株（JSYZ-D）由本实验室分离并保存；大肠杆菌DH5α 感受态细胞由本实验室制备；147 份病鸡临床样品（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、回肠、盲肠各21 份）采集自江苏省各地送至扬州大学动物医院就诊的疑似病例，病鸡均表现精神沉郁、垂翅等症状，剖检可见肝脏有坏死灶、盲肠有肿大栓塞或出血等病理变化；柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、弓形虫、犬巴贝斯虫等虫体DNA 由本实验室保存。

1.2 主要试剂10×PCR Buffer、dNTP、Taq 酶、限制性内切酶EcoR I、pGEM-T Easy、DNA Marker、DNA Ligation 试剂盒、DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等均购自TaKaRa 公司；蛋白酶K、RNase 购自上海生工生物工程公司；琼脂糖、IPTG、X-gal 购自美国Promega 公司；SYBR Green I Master 购自瑞士Roche 公 司。

1.3 引物设计与合成根据文献[9]设计PCR 引物：F1：5'-GAAAGCATCTATCAGTGGAA-3'/R1：5'-GATC TTTTCAAATTAGCTTTAAA-3'，扩增片段长度576 bp，用于质粒标准品制备和后续的PCR 检测；根据火鸡组织滴虫18S rRNA 的保守区域[10]设计荧光定量PCR 引物：F2：5'-GGCGAAAGCATCTATCAAGTGG-3'/R2：5'-CTCGTCGGCATAGTTTAAGGTAGG-3'，扩增片段长度106 bp，引物由华大基因公司合成。

1.4 重组质粒标准品的制备以DNA 提取试剂盒提取火鸡组织滴虫基因组DNA为模板，使用引物（F1/R1）进行PCR 扩增。PCR 反应条件为：95 ℃2 min；95 ℃35 s，57 ℃35 s，72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃5 min。PCR 产物经1.2%琼脂糖凝胶中电泳，回收纯化后，克隆至pGEM-T Easy 载体构建重组质粒pGEM-T-Easy-HM1，经酶切鉴定后，由华大基因公司测序鉴定。利用NanoDrop2000 测定质粒浓度，换算成拷贝数，作为质粒标准品保存于-80 ℃备用。

1.5 荧光定量PCR 反应条件的优化以浓度为4.6×1011拷贝/μL的重组质粒标准品为模板，采用矩阵法分别对 引物浓度（5 μmol/μL、10 μmol/μL、15 μmol/μL、20 μmol/μL、30 μmol/μL）和退火温度（58 ℃、60 ℃、62 ℃）进行优化，摸索最佳反应条件。

1.6 标准曲线制备将已制备好的质粒标准品10倍倍比稀释（1012拷贝/μL～10-1拷贝/μL），在最佳反应条件下进行荧光定量PCR 扩增，选择连续的5 个浓度，构建标准曲线。

1.7 特异性试验以火鸡组织滴虫标准株、犬巴贝斯虫、弓形虫、鸡毒害艾美耳球虫、鸡柔嫩艾美耳球虫基因组DNA 为模板，采用建立的荧光定量PCR方法分别扩增，同时以双蒸水作为阴性对照，检测本研究建立的荧光定量PCR 方法的特异性。

1.8 敏感性试验将10 倍倍比稀释的质粒标准品（1012拷贝/μL～10-1拷贝/μL）作为模板，采用荧光定量PCR 方法扩增，以确定本研究建立的荧光定量PCR方法的检测下限，同时设双蒸水作为阴性对照。

1.9 重复性试验以同一批次提取的不同浓度质粒标准品（4.6×1010拷贝/μL、4.6×109拷贝/μL、4.6×108拷贝/μL）作为模板，采用荧光定量PCR 方法进行组内重复性试验，每个浓度重复3 次。同时将3个不同浓度质粒标准品分成3 个批次，采用荧光定量PCR 方法进行组间重复性试验。以评估本研究建立的火鸡组织滴虫荧光定量PCR 方法的重复性。

1.10 临床样品检测将本实验室采集的147 份鸡组织（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、回肠、盲肠各21 份）样品按常规方法处理消化后，利用DNA试剂盒提取病料的DNA 作为模板，利用本研究建立的火鸡组织滴虫荧光定量PCR 方法进行检测，每次检测均设置火鸡组织滴虫质粒标准品作阳性对照，双蒸水作阴性对照，记录试验结果，并同时利用本实验室前期建立的PCR 方法[5]进行检测，比较分析二者的检测结果。

1.11 数据处理与分析利用SPSS 22 软件对实验结果进行单因素“平均数+方差”分析，并进行Tukey、Duncan 多重比较，以p<0.05 作为显著性判断标准。

2 结 果

2.1 质粒标准品的鉴定结果以火鸡组织滴虫基因组DNA 为模板，PCR 扩增18S rRNA 序列，结果显示扩增得到576 bp 的目的条带。PCR 产物经纯化回收后连接pGEM-T Easy 载体，提取质粒后进行EcoR I 酶切鉴定，结果可见载体片段和576 bp 的目的片段（图1），经测序，结果显示其为火鸡组织滴虫18S rRNA 基因片段。NanoDrop2000 测定质粒标准品浓度为88.5 ng/μL，换算成拷贝数为4.6×1012拷贝/μL。

2.2 荧光定量PCR 反应条件优化结果经数次试验，并对荧光定量PCR 结果进行分析，最终确定反应条件：反应总体系20 μL，其中SYBR Green I Master 荧光染料10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游引物（10 μmol/L）0.4 μL，质粒模板2 μL，用双蒸水补足至20 μL；反应程序为：95 ℃300 s，95 ℃10 s、60 ℃10 s、72 ℃15 s，共40 个循环。

2.3 标准曲线的建立根据检测结果建立荧光定量PCR 的标准曲线（图2A）与熔解曲线（图2B）。结果显示当质粒浓度为4.6×106拷贝/μL～4.6×1010拷贝/μL时，其与Cq值的线性关系最佳（图2）。Cq值和标准品拷贝数（q）之间的线性关系表达式：Cq=-3.32log10（q）+58.19，R2=0.9939，Error=0.369，E=2.001。

图2 荧光定量PCR 标准曲线（A）与熔解曲线（B）Fig.2 Standard curve(A) and melting curve(B) of qPCR

2.4 特异性试验结果利用所建立的荧光定量PCR方法检测常见的几种寄生虫基因组，并以双蒸水作阴性对照。结果显示，除火鸡组织滴虫外，其余病原均无特异性扩增（图3），表明所建立的火鸡组织滴虫荧光定量PCR 检测方法特异性较强。

图3 特异性试验结果Fig.3 Specificity test of the qPCR

2.5 敏感性试验结果分别以各个稀释度的重组质粒标准品（4.6×1012拷贝/μL～4.6×10-1拷贝/μL）进行荧光定量PCR 扩增，结果显示，当反应体系中含有4.6×102拷贝/μL 质粒标准品时仍可产生特异性扩增，而阴性对照无扩增（图4）。表明本研究所建立的方法敏感性较高。

图4 敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity test of the qPCR

2.6 重复性试验结果批内重复性试验结果显示变异系数在0.09%～0.33%，批间重复性试验变异系数在0.08%～0.21% 。批内及批间变异系数均小于1%（表1），3 次试验结果经方差分析，差异无统计学意义（p>0.05）。表明建立的火鸡组织滴虫荧光定量PCR 方法重复性较好。

2.7 临床病料中火鸡组织滴虫检测结果利用建立的荧光定量PCR 方法对147 份临床样品的DNA 进行检测，并与普通PCR 检测方法进行比较，结果显示，荧光定量PCR方法的总检出率为42.9%（63/147），略高于普通PCR 方法的总检出率37.4%（55/147）。其中，肝脏、盲肠的检出率分别达到71.4%和66.7%，明显高于普通PCR的检出率57.1%和52.4%（p<0.05），表明本研究所建立的火鸡组织滴虫荧光定量PCR 检测方法敏感性更佳，可以用于临床样品的检测。

表1 荧光定量PCR 重复性试验结果Table 1 The result of qPCR repeatability test

表2 两种方法检测病死鸡脏器组织结果的比较Table 2 Compairation of two different methods for detection of H. meleagridis in organs of sick chicken

3 讨 论

本实验根据火鸡组织滴虫的18S rRNA 基因序列，设计了荧光定量PCR 检测引物，经PCR 扩增其18S rRNA 基因后，构建了含该基因的标准品，并进行了荧光定量PCR 条件优化，绘制了标准曲线，建立了火鸡组织滴虫的SYBR Green I 荧光定量PCR 检测方法。特异性试验显示，本实验建立的方法可以有效地区分组织滴虫与鸡盲肠球虫及其他相似原虫。敏感性试验显示，所建立的荧光定量PCR 方法检测质粒标准品的下限为4.6×102拷贝/μL，较本实验室之前建立的普通PCR 方法的检测限高了100倍[5,11]，检测结果更加准确。重复性检测结果表明，该技术重复性较好，在实际生产中具有较高的适用性。利用该荧光定量PCR 方法检测临床疑似火鸡组织滴虫感染的病料样品时，总阳性率比常规PCR方法的检测阳性率高5.5%（42.9%/37.4%）。并且两种检测方法在肝脏、盲肠这两个靶器官的检出率存在显著差异（p<0.05）。

本研究中初步建立的荧光定量PCR 方法特异性强，检出率和准确率较高，与Hafez 等人的结论基本相符[7]。本实验建立的检测方法敏感性较Hafez 的检测方法高1 000 倍[7]，究其原因，可能是两者扩增的靶基因不同所致。Hafez 等人采用的靶基因是将火鸡组织滴虫与毛滴虫基因序列进行比对后筛选的是同源性最低的部分序列，而本实验所用目的基因为火鸡组织滴虫特异性多拷贝的18S rRNA 序列。此外，本实验所用的荧光定量PCR 引物、反应体系和反应条件也存在一定的差异。与Meike 等人[8]所建立的原位杂交法相比，本研究建立的荧光定量PCR 方法不仅特异性上与之相当，而且操作更简便，检测速度更快，且成本更低。相比普通PCR 方法，本研究所建立的荧光定量PCR 方法对临床疑似病料中的火鸡组织滴虫检出率更高。本研究建立的该方法为临床上禽组织滴虫病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术手段。