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候选结核疫苗的评价模型

2020-12-30杨淑凤邓国英孙文长

微生物学杂志 2020年5期
关键词:动物模型临床试验结核

杨淑凤, 邓国英, 白 璐, 孙文长*

(1.大连医科大学 微生物学教研室,辽宁 大连 116044; 2.大连市海关技术中心,辽宁 大连 116022)

卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)作为唯一合法使用的预防结核病疫苗,在一定程度上能降低儿童播散性结核,例如结核脑膜炎和粟粒性结核的发病,但无法提供充足的保护力。所以结核病依然是严重威胁人类健康的疾病。尤其是多重耐药结核(multidrug-resistant TB,MDR-TB) 和泛耐药结核(extensively drug-resistant TB,XDR-TB)的出现。仅2016年,在全球确证的662万结核病例中就有约15万MDR-TB,8千余例XDR-TB[1]。因此筛选更高保护力的候选疫苗迫在眉睫。到目前为止,约有12种处在不同临床试验阶段的候选疫苗[1],这些疫苗在进入临床试验前必须评价其安全性、免疫原性和有效性[2]。本文从体内和体外两个方面论述临床试验前的疫苗评价体系,对候选疫苗评价体系的充分认识是筛选优质候选疫苗的重要依据。

1 体内评价体系

1.1 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)攻击模型

1.1.1 攻击对象 使用M.tb攻击模型来评价候选疫苗的有效性,是指在疫苗接种后让动物感染M.tb。攻击菌株多为标准毒株H37Rv,常使用的动物包括小鼠、豚鼠以及非人类灵长类(non-human primates, NHP) 动物等。小鼠因其低成本、大样本数据易获得以及易于标准化实践操作等优点,已成为疫苗评价中最普遍使用的初筛动物模型,常采用C57Bl/6、BALB/c以及C3HeB/FeJ等品系。值得一提的是,使用C3HeB/FeJ品系的小鼠建模能形成中性粒细胞渗出、损伤严重并发展为液化为主要特征的病灶,与人体结核渗出液化病灶非常相似[3],因此,很多候选疫苗多采用C3HeB/FeJ品系建模。此种小鼠模型与人暴露在活动肺性结核的高风险非常相似,因此也常用于控制此类人群感染的疫苗评价[4]。需要指出的是,小鼠缺乏针对M.tb糖脂抗原所必需的CD1b[5]。豚鼠模型多应用于经过小鼠模型初筛成功的候选疫苗的进一步有效性评价,而豚鼠模型的结果往往也是该候选疫苗能否进入临床试验的重要“门槛”[5]。非人灵长类动物因其与人类近源性、高度相似的免疫反应,成为评价候选疫苗进入临床试验中最具有吸引力的工具[6],但因高成本及对人员专业性的要求,使得NHP模型仅应用在经过小鼠模型、豚鼠模型筛选后的进一步确证中。

1.1.2 攻击途径M.tb攻击模型常用的攻击途径为低剂量气溶胶。以小鼠模型为例,在设备封闭空间里,利用2 μm的气溶胶,通过呼吸道使小鼠肺部接种50 CFUs(colony forming units)的M.tb[7]。低剂量气溶胶途径建立的攻击模型,仅能模拟人群感染M.tb后损伤被控制或者细菌增殖但又不引起渗出和空洞的免疫状态。此外,在低剂量气溶胶方法基础上建立模型后,持续使用抗结核药物至病灶中仅存耐药M.tb,则能建立起潜伏感染小鼠模型。此模型常用于评价某些治疗型疫苗的效果[8]。 除气溶胶途径外,还有气管内接种途径,通过大剂量(1×106CFUs) 的M.tb气管内接种,形成吸入性肺炎。气管接种途径目前主要应用于M.vaccae候选疫苗的测试[9]。目前认为此类疫苗有助于Th2反应转变为Th1反应[9]。最新的一个BCG接种途径研究可以说是结核疫苗领域中的一个重大革新:改变传统的BCG接种途径,经静脉注射免疫恒河猴。发现这种免疫接种途径能在恒河猴体内诱导出针对M.tb接近100%的保护力[10]。这个重大发现也说明BCG产生免疫保护的机制应该是细胞免疫、体液免疫和固有免疫的综合作用结果[10]。

1.1.3 评价指标M.tb攻击模型常用的评价指标包括肺部荷菌量、肺部病理评分以及受试对象的存活期。而候选疫苗优于传统BCG的标准则是在攻击3周后,肺部的荷菌量相对于对照组至少要降低0.7 log10CFUs以上[2]。需要指出的是,无论哪种动物模型都不能完整地模拟出人类M.tb的感染状态。

1.2 BCG攻击模型

1.2.1 攻击对象 BCG攻击模型最大的优势就是受试对象可以是人,这在候选结核疫苗有效性评价中最具应用前景。在可控的条件下,以人作为受试对象来评价疫苗的有效性,在疟疾疫苗[11]和伤寒疫苗[12]研究中有过先例。BCG作为活菌疫苗非常安全,可在人体内短期存活复制,能够引起可控的短期分枝杆菌感染,可使用BCG攻击人[13]。此外,在疫苗筛选最初阶段,在实验室阶段达不到人体使用标准时,也可以使用动物作为BCG攻击的受试对象,例如兔子[14]。BCG攻击模型规避了专业实验室的局限(M.tb攻击必须在生物安全级别为3级的实验室操作)和人员感染的风险,在候选疫苗评价中极具应用前景。

1.2.2 攻击途径 目前报道,BCG攻击的途径为受试对象皮内注射。通过在志愿者皮内接种标准剂量的BCG和安卡拉病毒85A疫苗(Modified virus Ankara expressing the conserved mycobaterial 85A,MVA85A),两周后活检攻击部位的组织,评价人体的抗结核免疫能力[13]。由于皮内注射与M.tb实际感染方式存在差异,因此,BCG气溶胶攻击模型还在探索中[15]。

1.2.3 评价指标 BCG攻击模型的评价指标是通过测定攻击部位活体组织的BCG荷量反映,即CFUs数目以及菌DNA定量,来反映人体的抗结核免疫能力[13]。此外,通过对攻击剂量的比较,发现在志愿者能承受范围内,高剂量组(即3倍于标准剂量)结果检测更为灵敏[13]。

1.3 其他模型

出于人道主义以及动物的替代、减少和优化(replacement, reduction and refinement,3R)原则,低感知的动物模型也应用在结核疫苗评价研究中[15]。低感知动物包括阿米巴、果蝇和斑马鱼等。尤其是海洋分枝杆菌(Mycobacteriummarinum)感染的斑马鱼能模拟出人类结核病急性和潜伏感染状态,因此,也是很多治疗性疫苗和DNA疫苗经常使用的模型[15]。

2 体外评价体系

尽管还没有明确的生物标记预示机体对M.tb的保护力,但一些候选疫苗的评价结果也揭示了某些免疫细胞和抗体与M.tb保护力相关,例如在MVA85A的IIb临床测试中,虽然结果显示接种和未接种与传统BCG并无明显的保护力差异,但分泌IFN-γ的BCG抗原特异的T细胞和高效价的Ag85A IgG与M.tb保护力相关[16]。这些与免疫保护相关的生物标记物的确定加快了候选疫苗的研发,某种程度上也推动了候选疫苗进入临床前试验的进程,为候选疫苗进入临床I期试验提供了有效的免疫原性相关检测指标。目前应用最多的体外评价指标是结核菌生长抑制试验(mycobacterial growth inhibition assays,MGIAs)等。

2.1 MGIAs

MGIAs是指在体外将巨噬细胞等和M.tb等共培养,模拟分枝杆菌感染后,加入疫苗接种前后受试对象的全血或者某些类型免疫细胞,如淋巴细胞,通过评价机体或者特种类型免疫细胞对M.tb生长的抑制能力,来反映该疫苗的有效性。受试对象可以是人,也可以是动物(如牛或者小鼠)。MGIAs检测的M.tb也不限H73Rv标准毒株,还可以是分离到的各种临床强毒株[17]。此外,MGIAs也避免了对动物的体内攻击,是对动物3R原则的很好体现。MGIAs除了主要反映Th1类细胞对M.tb的清除能力外,还反映了体液免疫如特异抗体、天然免疫细胞包括抗原递呈细胞(树突细胞)、自然杀伤细胞和中性粒细胞等对M.tb的清除能力[17]。

2.2 生物信息学和数学模型

已知M.tb和宿主的基因序列,同样能应用生物信息学方法进行计算机推演来确定候选结核疫苗[15],例如熟知的BCG与M.tb基因序列相比较后确定的差异区域RD(region of difference),很多亚单位疫苗成分是RD蛋白;通过生物信息学方法分析RD蛋白与人类白细胞抗原I等位基因的亲和力,根据高亲和力确定潜在的候选疫苗抗原;生物信息法还可以确定潜在的激活人类CD8+T细胞的M.tb抗原[18]。此外,随着电子技术的快速发展,很多数学对接模型、抗原预测软件不断产生和更新,例如基于VaxiJen预测抗原软件和氨基酸序列比对原理的NERVE(new enhaced reverse vaccinology enviroment)预测的6个候选结核疫苗[19]。这些数字化模型更体现低成本、高效性和精准性,也是对体内动物模型3R原则的体现和运用。

3 疫苗评价模型数据解析时需考虑的因素

3.1 体内模型的种属差异

体内模型,如目前广泛使用的动物模型,与人类的种属差异影响其结果对人类临床试验的预测。NHP模型虽然近源,但也因其高成本和伦理学等因素使其不能作为常规筛选模型。正因为如此,NHP模型更应统一流程并规范影响因素,以便不同地区课题组的数据具有比较性和综合分析性,最大化发挥NHP模型的价值。被寄予厚望的MVA85A,在小鼠模型、豚鼠模型、NHP模型以及牛等体内的表现均优于传统BCG的保护,但在婴幼儿的临床IIb试验中并未表现出优于传统BCG的保护力[16],说明也许种属差异是其中的原因,另外也可能是在MVA85A的IIb临床测试中,受试对象年龄差异导致,动物模型受试者均为成年,而临床试验对象为婴幼儿[20]。因此,体内模型数据对候选疫苗进入临床试验的意义重大,有赖于更多M.tb保护力的生物标记物的确证。

3.2 体内模型的攻击菌株和暴露时间

体内模型(如动物模型)采用的攻击菌株多为单一的实验室可控标准毒株H37Rv,感染方式多为持续暴露在高剂量的感染源环境中。人群感染M.tb涉及多个免疫机制的复杂过程,而衡量疫苗保护力的唯一标准是是否感染M.tb。加上目前临床分离的菌株及其毒性和耐药性多样,与实验室标准株有差异,因此,菌株和暴露时间也影响体内动物模型对人群临床试验的预测。

3.3 临床试验设置

人群临床试验综合考虑因素众多,包括受试对象的年龄、性别、BCG成疤历史等。要综合首要设定因素遴选受试对象[21]。试验受干扰的因素也很多,包括饮食、对环境中其他分枝杆菌和寄生虫等病原体的暴露程度等等,而这些因素在临床前的体内外评价模型中可被规范并降低[2]。因此临床试验的复杂试验参数也影响临床前的体内外模型数据在人群临床试验重现。MVA85A的IIb临床试验没有再现临床试验前动物模型的保护力,就是一个实例[21]。

3.4 疫苗保护效果的界定

目前,对候选疫苗的筛选都是以保护力是否高于BCG为标准的,BCG在人群中的保护力约为60%[2]。动物模型中对候选疫苗有效性的界定,依据的是对疾病相关症状如肺脾的荷菌量、病理表现以及存活期等与BCG对照组是否具有统计学差异。而在人群试验中,这些依据则不能作为界定标准,人群中对疫苗保护力界定的唯一标准就是感染M.tb。很多候选疫苗在动物模型中能降低0.5~1.0 log10CFUs的荷菌量, 这对于其在人群中阻止感染的程度还不得而知[2,20]。

4 小 结

到目前为止,所有的候选疫苗还没有一个能在评价模型中预防M.tb感染的发生。而人类感染结核是个非常复杂的过程,结果既有感染痊愈者,又有潜伏感染者,还有复发者以及活动性和播散性结核[22]。在目前缺乏疫苗保护力界定标准的情况下,进行临床试验前评价依然是筛选候选疫苗的首选。对候选疫苗评价模型的充分认识和模型数据的充分利用将有利于提高评价模型对人群的预测价值,也是动物3R人文精神的体现。

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