代谢组学研究技术及其在银屑病研究中的应用进展

舒 心，王 睿，黄 敏 综述 李承新 审校

代谢组学是继基因组学和蛋白组学之后新发展起来的一门学科，是以研究细胞、组织或生物体受刺激后代谢组变化的科学，其研究对象大多是相对分子质量1000以内的小分子物质，目前已渗透到多项领域，如疾病诊断、医药研发及营养食品科学等。代谢物是指作为细胞通路底物、中间体和产物的小分子物质。代谢物的研究一直是我们了解人类健康和疾病不可或缺的一部分。一个生物系统中所有的代谢物共同组成了代谢组，它代表了基因表达、表观遗传学、蛋白质活性和环境影响的最终结果。近几年，代谢组学已被应用于皮肤病的研究，包括识别转移性黑色素瘤[1-2]、基底细胞癌[3]、急性间歇性卟啉症[4]和特应性皮炎[5]等特异性生物标志物。银屑病是一种慢性炎性反应性疾病，具有免疫介导的多基因遗传性，一直是皮肤科研究的重点和难点。近几年，代谢组学研究为银屑病发病机制的探索和特异性诊断生物标记物的寻找提供了重要依据，因此也是皮肤科领域非常有价值的一个研究。笔者就常用的代谢组学分析方法、银屑病代谢组学的研究成果及进展做一综述。

1 代谢组学研究技术

代谢组学研究可分为靶向和非靶向两种。靶向代谢组学是对一组预先指定的代谢物进行分析，通常与一个特定的通路或代谢网络相关；非靶向代谢组学研究目标是产生代谢活动的整个网络框架，不仅仅是特定的已被预先定义的代谢物。非靶向代谢组学研究方法包括代谢指纹识别及代谢产物分析，代谢指纹识别是利用代谢物组成的模式来分类或识别样本，而代谢产物分析则是同时测量尽可能多的代谢物，全面反映生物系统中的代谢活动。上述代谢组学所产生的数据是高通量的，非常复杂，需经过专业的生物信息学软件处理，如各种形式的色谱质量谱等，并需要与代谢物数据库相比照，如METLIN[6]数据库和人类代谢组数据库[7]。同时，为了更好地解释这些处理后的数据，它必须被映射到代谢途径数据库，如MetaboAnalyst[8]和MetaMapR[9]，从而进行代谢通路和网络的分析。

目前，代谢组学在临床研究中常用的检测技术包括核磁共振技术( nuclear magnetic resonance，NMR) 、气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-massspectrometer，GC-MS)、液相色谱-质谱联用技术(liquidchromatography-mass spectrometer，LC-MS)等，主要用于检测血液、尿液、唾液和组织等生物标本中代谢物的变化[10、11]。NMR具有快速、全面、样品处理简单、重现性好等优点，是代谢组学研究领域最为常用的分析技术之一，目前已广泛应用于疾病诊断、新药研发等领域[12]。GC-MS气相色谱具有较高的灵敏度和分析效能，在疾病诊断研究中亦有一定应用，但GC需对样品进行衍生化处理，并受组分挥发性和热稳定性所限,在疾病诊断中的应用具有一定局限性[11]。LC-MS 技术用于代谢组学的研究最晚，但由于LC-MS 技术本身的强大优势及其与NMR和GC-MS 技术的互补性，它的发展速度及应用已经超越了NMR和GC-MS。相比较而言，LC-MS 避免了GC-MS中繁杂的样品前处理，且由于其较高的灵敏度和较宽的动态范围，现已被越来越多地用于代谢组学的研究，尤其是非常适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定[13]。

2 在银屑病研究中的应用进展

2.1 皮肤代谢组学 通过皮肤代谢组学研究，人们已经发现了银屑病患者皮损与健康对照组皮肤中代谢产物的差异。在这些代谢物中，有一些与皮肤增生和高代谢相关，如谷氨酸、胆碱、缬氨酸、葡萄糖和肌醇。文献[14，15]利用NMR和GC-MS两项研究发现，与健康对照组相比，银屑病患者皮损中的谷氨酸含量增加，这种增加可能是由于在细胞增生、蛋白质快速合成和细胞因子产生过程中对谷氨酰胺的需求增加引起的。同时，胆碱是细胞生长和分裂所需要的基本物质，胆碱在银屑病病变皮损中的含量明显高于健康对照组。此外，根据银屑病斑块严重程度量表，发现谷氨酸和胆碱与银屑病严重程度呈正相关，这可能是由于细胞增殖和炎性反应增加所致。

皮肤的代谢组学不但揭示了银屑病细胞高周转率和免疫失调的生化特征，同时也证实了银屑病的发病机制可能与角质形成细胞的过度增殖有关。Abeyakirthi等[16]应用高效液相色谱质谱法(HPLC-MS)分析了健康对照组和银屑病患者的皮损样本，结果表明，在银屑病病变皮损中，鸟氨酸水平升高，精氨酸水平下降。这些代谢紊乱是由于精氨酸酶1的过表达，后者是一种与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)竞争共享底物精氨酸的酶。精氨酸酶1增加精氨酸的使用，降低了其对iNOS的利用，从而导致NO水平降低，促进了银屑病表皮增生。除了NOS通路外，花生四烯酸代谢物已被证实为银屑病发病机制的潜在促进因素，并有希望成为银屑病有效的治疗靶点。花生四烯酸是一种多不饱和-6脂肪酸(PUFA)，可被环氧合酶21、脂氧合酶(LOX)22和细胞色素P450酶氧化成多种二十烷酸[17]。值得注意的是，脂氧合酶 (LOX)途径产生的羟二十烷四烯酸(HETEs)和白三烯B4 (LTB4)，即白细胞趋化剂，可诱导角质形成细胞活化和中性粒细胞介导的银屑病。其他一些基于皮肤的代谢组学研究发现，花生四烯酸、羟二十烷四烯酸(HETEs)和白三烯B4(LTB4)在银屑病皮损中浓度较高，从而证实了银屑病皮损中脂氧合酶(LOX)介导的白三烯的生成在银屑病发病机制中的重要作用[18,19]。

与血液和尿液样本代谢组学研究相比，皮肤组织提供了对银屑病发病过程和皮肤局部变化最直观的反映。虽然皮肤代谢组学具有侵袭性，但直接对银屑病病变进行采样，可以将代谢组学数据与病变形态、局部炎性细胞和角质形成细胞的基因表达数据相关联。因此，基于皮肤的代谢组学最有可能阐明诱发疾病的免疫机制，并确定有效的治疗靶点。

2.2 血液代谢组学 银屑病代谢物不仅可在皮肤上进行研究，血液样本色谱技术的出现也为进一步探索银屑病代谢过程提供了可能。血中关键代谢物(包括氨基酸、脂质和脂肪酸衍生物)的比值和浓度已被证实在银屑病和其他自身免疫性疾病的发病、预后和治疗中发挥重要作用。

蛋白质代谢产物往往是复杂代谢途径的最终产物，因此常与疾病的性质类型关系最为密切。因此，了解银屑病患者的氨基酸谱可以更好地了解疾病的转归过程。也就是说，从分子水平了解银屑病的发病机制一直是银屑病研究领域的重点和难点。Armstrong等[20]利用GC-MS分析了寻常型银屑病、关节型银屑病和健康对照组血清代谢产物差异，以阐明银屑病的发病机制，包括角质形成细胞增生和免疫细胞的过度激活，结果发现，与健康对照组相比，银屑病患者的谷氨酰胺和天冬酰胺总体水平较低。细胞蛋白合成和生长中起重要作用的谷氨酰胺，可能被银屑病患者体内过度活跃的免疫细胞所消耗。同时，天冬酰胺在高氧化应激的环境中，如银屑病炎性环境中，会发生破坏和自发脱酰胺。因此，银屑病患者较低水平的天冬酰胺可能反映了银屑病中较高的细胞周转率和慢性炎性状态。2015年Kamleh等[21]进行的LC-MS研究和Kang等[22]在一项对银屑病及健康人的GC -MS研究均显示，尿素循环、精氨酸和脯氨酸途径的活性增加，并发现异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸水平在银屑病患者中升高。除此之外，这些支链脂肪酸在糖尿病和心血管疾病中也会升高，预示着银屑病与心脏及一些代谢疾病之间存在密切关系[23-25]。Li等[26]通过对75例银屑病及75名健康人的血清LC-MS代谢组学研究，发现银屑病主要代谢途径涉及甘油磷脂代谢、鞘磷脂代谢、花生四烯酸代谢,并寻找出44个显著差异的代谢产物，包括溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油及磷脂酰乙醇胺等。

血清代谢组学也可被用来区分银屑病和其他自身免疫性疾病。利用LC-MS和GC-MS的组合，Madsen等[27]比较了类风湿关节炎、关节型银屑病和健康对照组之间的血清代谢物。他们的研究明确了可用于区分关节型银屑病和类风湿关节炎的血清代谢物变化特征谱，敏感度达90%，特异度达94%。关节型银屑病患者与类风湿关节炎患者相比，其谷氨酸和丝氨酸水平较高，谷氨酰胺水平较低,与Kamleh等[21]的研究结果一致，从而进一步强调了代谢组学对鉴别疾病和检测生物标记物的巨大潜力。

2.3 尿液代谢组学 以尿液为基础的代谢组学分析方法具有简单、无创的特点，值得在临床广泛推广。目前在国内外医学文献中，只有少量利用尿液代谢组学研究银屑病的文献报道。2015年，Setkowicz等[28]通过分析尿代谢物12-羟二十烷四烯酸(12(S)-HETE)与皮损严重程度的关系，确定了寻常型银屑病和关节型银屑病患者的诊断生物标志物。该研究提出，12-羟二十烷四烯酸(12(S)-HETE)作为一种有效的白细胞趋化剂，是一种花生四烯酸盐脂氧合酶(LOX)的代谢产物，已被证实在银屑病患者皮损中含量明显增加。因此，可作为诊断寻常型银屑病的一种特异性生物标志物。Alonso等[29]通过比较寻常型银屑病、关节型银屑病、类风湿关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎和系统性红斑狼疮的代谢产物特征，研究尿液中其他潜在的生物标记物。与对照组相比，寻常型银屑病和关节型银屑病的柠檬酸盐、丙氨酸、甲基琥珀酸盐、葫芦巴碱、肉碱和马尿酸盐的含量较低。在关节型银屑病患者中，枸橼酸水平与疾病活动性呈负相关，它对评估疾病严重程度和监测治疗反应具有一定帮助。同时，研究结果表明银屑病和类风湿关节炎具有不同的代谢产物特征，这些差异性的代谢产物可用于它们之间的鉴别诊断，该结果与Madsens小组的血液代谢组学研究结果一致[27]。

尿液中检测出的生物标志物也可以帮助预测或监测治疗反应。Kapoor等[30]在2013年的一项研究中通过H-NMR(氢核磁共振谱)分析了20例关节型银屑病和16例类风湿性关节炎应用抗TNF-α药物英夫利昔单抗及依那西普后尿代谢产物的变化。研究发现英夫利昔单抗和依那西普对尿液中代谢物的影响不同。英夫利昔单抗治疗组尿液中马尿酸、柠檬酸、乳酸代谢水平较高，而依那西普组尿液中胆碱、苯乙酸代谢物、尿素，肌酸和甲胺水平较高。虽然依那西普和英夫利昔单抗均具有免疫调节作用，但它们可诱导不同的基因抑制模式。英夫利昔单抗下调许多Th1基因，而依那西普则是抑制了促进滤泡树突状细胞发育和淋巴器官生成的基因。这一系列研究结果强调了尿液代谢组学可作为一种方便、无创的方法来识别生物标志物并监测长期的治疗反应。

代谢组学已极大地改变了我们对银屑病的认识。对皮肤、血液和尿液样本代谢物的研究揭示了健康个体和银屑病患者之间代谢产物差异的趋势。高精度、高通量的代谢组学技术与复杂生物信息学的融合应用，为发现具有重要诊断及治疗价值的新型、特异性银屑病生物标记物开辟了新途径。代谢组学技术已成为银屑病研究中一个有价值的研究工具，但它也有其重要的局限性，如成本高、缺乏标准的诊断浓度标准及需要进行数据验证等。虽然代谢途径和网络分析为代谢组学数据提供了重要的生物学背景，但应强调的是，这些数据虽提供了有关联的证据，但不一定是因果关系,因此仍需要进一步地分析研究，了解其在银屑病发病机制中的作用。