PD-1/PD-L1信号通路在慢性乙型肝炎患者免疫调节中作用的研究进展

刘娇，戢敏，陈星，喻雪琴，陈芳，赵川

1遂宁市中心医院，四川遂宁629000；2川北医学院附属医院

乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重威胁人类健康的病原体。据报道，全球每年约有65万人死于HBV相关性肝衰竭、肝硬化及肝癌[1]。乙型肝炎发病机制十分复杂且尚未形成共识。HBV感染后的病程及转归与病毒、宿主间的免疫应答关系密切，特别是T淋巴细胞介导下的细胞免疫。T淋巴细胞数量减少及功能衰竭是导致病毒不能被有效清除而诱发HBV感染后慢性化的主要原因之一。程序性死亡分子1(PD-1)及其配体(PD-L)是新发现的B7/CD28家族成员之一，是具有负性协同共刺激信号的调节分子。PD-1在慢性感染性及自身免疫性疾病的发生发展及转归中起重要的调控作用。这些疾病发生的病原体或诱导疾病发生的影响分子与PD-L结合形成信号通路后，诱导其向T淋巴细胞传递负性刺激信号，导致T淋巴细胞数量减少，生物学功能衰减，T淋巴细胞介导下的免疫应答减弱。本文就PD-1/PD-L1信号通路对慢性乙型肝炎(CHB)患者免疫调节的影响作一综述。

1 PD-1/PD-L1信号通路概述

1.1 PD-1、PD-L1的结构及表达 CD279是Ishida等[2]于1992年从凋亡的T淋巴细胞膜上分离出的单体型Ⅰ型跨膜糖蛋白，称为PD-1。PD-1由288个氨基酸残基组成，相对分子质量为55 kD。PD-1由胞外的N端域、跨(穿)膜结构域及胞内结构域三部分组成，与CD28、CTLA-4分别有28%、23%的氨基酸同源性[3]。其胞外区由含有4个N端连接的糖基化位点构成的IgV样结构域，PD-1/PD-L1信号通路主要通过4个N端连接的糖基化位点发生去磷酸化；胞内结构域的N端酪氨酸残基通过免疫受体酪氨酸转换基序(ITSM)来发挥调控作用。当PD-1、PD-L1结合时，ITSM可募集磷酸酶(SHP-1、SHP-2)诱导B淋巴细胞受体或T细胞受体传递的效应信号发生去磷酸化，从而发挥负性调节抗原信号的作用[4]。PD-1广泛表达于CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)及单核细胞等膜表面，而静息状态下的T淋巴细胞表面不表达PD-1[5，6]。

PD-1有PD-L1、PD-L2两个配体。PD-L1与PD-L2有70%的氨基酸同源性，其中有40%氨基酸为一致性。PD-L1由290个氨基酸组成，胞外区由IgV和IgC样两个结构域。PD-1与PD-L1间的融合主要发生在IgV样结构域。PD-L1分布较PD-1更为广泛，其除在PD-1表达的细胞表面外还可在正常器官如胎盘、心脏、肝、肺等多种组织细胞表面被诱导表达[7]。PD-L2的表达则较PD-1、PD-L1局限，主要在T淋巴细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、星状细胞以及肝窦内皮细胞等细胞膜表面表达[8]。

1.2 PD-1/PD-L1信号通路的生物学功能 PD-L1对外周组织有保护作用，保护外周组织不因自身免疫紊乱而受到攻击。实质细胞通过PD-1/PD-L1信号通路维持机体的免疫耐受状态；PD-1/PD-L1信号通路被阻断或破坏时，可诱发或加重慢性感染，促进自身免疫性疾病发生发展及肿瘤的发生[9]。实验研究结果显示，PD-1/PD-L1信号通路具有传递负性调节信号的功能，可抑制T淋巴细胞活化、增殖及分化，减少γ-干扰素因子(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素2(IL-2)等细胞因子分泌，导致T淋巴细胞生物学功能减弱，减低机体对病毒的免疫应答，从而导致病毒持续复制，疾病慢性化。Barber等[8]研究发现，在淋巴脉络丛脑膜病毒感染的小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表面PD-1表达上调，外周血T淋巴细胞表面水平及其分泌的细胞因子水平降低。研究发现，在乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒、人类免疫获得性病毒及人类T淋巴细胞病毒等感染中，PD-1在特异性CD8+T和CD4+T细胞膜上表达水平与病毒载量呈正相关[10]。动物实验研究发现，在阻断PD-1/PD-L1信号通路后，PD-1、PD-L1表达下降，T淋巴细胞载量及功能、细胞因子分泌功能有所恢复，活跃的病毒复制状态得到控制[11]。这表明阻断PD-1/PD-L1信号通路可作为治疗慢性病毒感染的新方向。

2 PD-1/PD-L1信号通路对CHB患者免疫的调节作用

2.1 PD-1/PD-L1信号通路与CHB的关系 乙型肝炎的发病机制十分复杂，大部分学者认为宿主免疫功能失衡是其病理性损伤及感染慢性化的主要原因之一；同时指出CHB是免疫介导的疾病，其发生发展与机体免疫活化、肝细胞损伤有关，最终疾病的控制需依赖于机体的免疫状态。因此免疫调节是CHB治疗的一个非常重要的环节。T淋巴细胞作为细胞免疫的主要效应细胞，其数量、功能、亚群比例及细胞因子分泌等与HBV持续感染或感染后的慢性化密切相关。T淋巴细胞在双信号的诱导下激活，一是T细胞受体专性识别抗原呈递细胞表面的肽复合物信号刺激；二是T细胞表面的膜蛋白分子及其配体介导的共刺激信号作用。其中CD28/B7、ICOS/B7-H2等正性共刺激分子途径传递活化信号，刺激T细胞增殖和分化；而PD-1/PD-L1作为负性共刺激信号途径传递抑制信号，导致T淋巴细胞凋亡，功能减弱，CHB患者形成免疫耐受状态。PD-1、PD-L1作为负性共刺激分子传递活化信号在CHB免疫调节、疾病的发生与转归中发挥着非常重要的调控作用。Liu等[12]阻断HBV感染土拨鼠PD-1/PD-L1信号通路，小鼠外周血特异性T淋巴细胞功能得以恢复，并认为PD-1/PD-L1信号通路在HBV感染中具有负性调控作用。孙立华等[13]研究结果显示，CHB患者外周血CTL表面PD-1、PD-L1的表达高于健康体检组，且PD-1、PD-L1表达水平与HBV-DNA载量呈正相关系。Liang等[14]研究发现，CHB免疫清除阶段PD-1表达水平高于免疫耐受阶段、静止期病毒携带阶段。可见，PD-1、PD-L1表达在一定程度上反映了CHB患者的免疫功能及病情严重程度。

CD4+T细胞为T淋巴细胞中的一种辅助性T淋巴细胞，主要通过分泌IFN-γ、IL-17、IL-10及IL-2等细胞因子来诱导和促进B细胞、CTL及其他免疫细胞的活化、增殖与分化，从而介导机体免疫应答。CD8+T细胞具有杀伤效应细胞和调节细胞免疫的作用，是清除病毒的关键细胞亚群，若应答失败会导致病毒处于高水平状态且不能被清除。在CHB患者中，CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达增加，PD-1/PD-L1信号通路传递负性信号因子，导致CD4+、CD8+T淋巴细胞数量减少，功能减退，导致具有抗病毒作用的肿瘤坏死因子α、IFN-γ等细胞因子水平降低。Peng等[15]研究发现，活动期CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达明显高于急性乙型肝炎恢复期患者。Fan等[16]研究也表明，CHB患者CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达较急性乙型肝炎恢复期患者高，CHB患者外周血CD8+T淋巴细胞功能和数量衰减更为明显。车财妍等[17]研究发现，CHB患者外周血CD4+T和CD8+T淋巴细胞PD-1的荧光强度明显高于HBV携带者。肝组织内CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达高于外周血[18]。在HBV感染初期，CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达明显上调，但随着患者病情状况的改善和病毒清除，PD-1表达下调，CD8+T淋巴细胞的生物功能和增殖能力复常[15]。PD-1高表达可抑制CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖与分化，这可能因为机体为控制过强免疫应答而发生的自我调控，防止T淋巴细胞的过度免疫攻击，避免肝组织损伤，但也成为HBV慢性感染的原因之一。

HBV-DNA是反映病毒复制水平最直接的指标之一。HBV-DNA高载量可诱导PD-1、PD-L1高表达，但同时随着病毒载量的降低与清除，PD-1、PD-L1的表达也随之下降。Wang等[19]研究发现，CHB患者高病毒载量组(HBV-DNA>105)外周血T淋巴细胞膜上PD-1表达较低病毒载量组(HBV-DNA<105)增加。叶翩等[20]研究结果显示，CHB患者CD8+T淋巴细胞表面的PD-1、PD-L1表达高于健康者，并发现CHB患者CD8+T淋巴细胞表面的PD-1/PD-L1表达与HBV-DNA载量呈正相关。但也有部分学者认为，CHB患者外周血PD-1/PD-L1表达水平与HBV DNA载量无相关性，且认为外周血T/B淋巴细胞表面PD-1/PD-L1水平与健康体检组比较，差异无统计学意义，同时有学者临床研究认为，CHB患者HBV-DNA阳性组的外周血CD4+T/CD8+T淋巴细胞表面的PD-1/PD-L1表达水平较阴性组比较差异无统计学意义[21]。HBV-DNA载量与PD-1/PD-L1两者之间相互关系尚未形成共识，有待更进一步地进行大数据、多中心研究来明确。

2.2 PD-1/PD-L1信号通路在HBeAg血清学转换中的作用 HBeAg是一种可溶性多肽蛋白，多见于血清中HBsAg阳性患者。HBeAg阳性表示患者处于高感染低应答期，HBeAg阴性而抗HBe阳性称为e抗原血清学转换，表明CHB患者机体由免疫耐受转为免疫激活状态，此时常处于病变活动的激化状态。相关研究结果显示，每年发生血清学转换的CHB患者约占10%。血清学转换后，多数患者体内病毒复制处于相对静止状态，传染性也相对降低。研究发现，HBeAg可促进PD-1/PD-L1高表达，HBeAg的血清学转换与CHB患者外周血清中HBV-DNA病毒载量及T淋巴细胞表面PD-1表达密切相关[22]。Tang等[23]研究发现，HBeAg阳性患者CD8+T细胞膜上PD-1表达高于HBeAg阴性患者。柳红梅等[24]研究发现，HBeAg阳性组外周血CD4+T淋巴细胞表面的PD-1表达上调，并与HBeAg水平呈正相关。PD-1/PD-L1信号通路可能参与并诱导了HBeAg的血清学转换，这也可能是机体发生免疫耐受的机制之一。

2.3 PD-1/PD-L1与肝组织炎症程度的相关性 ALT/AST在肝组织发生炎症时释放入血，是目前反映肝细胞损伤的最常用指标。在HBV持续性感染时，会导致肝细胞损伤，肝细胞胞浆及线粒体内的多种转氨酶释放入血所致。已有研究发现，PD-1/PD-L1表达水平与肝组织炎症损伤程度密切相关，随CHB患者的炎症程度加重其外周血的PD-1/PD-L1表达水平显著升高。韦麟等[25]研究发现PD-1表达水平与肝组织炎症活动度呈正相关，在肝组织未出现明显炎症时(G0期)，肝组织内PD-1低水平表达。在肝组织炎症活动度在G1-4期时，PD-1在肝组织内的表达水平高表达，随肝组织炎症程度加重，PD-1表达水平显著升高，G4期的PD-1表达水平较G0～1期显著升高，二者差异有统计学意义。Germanidis等[26]研究发现PD-1/PD-L1及CD8+T水平与肝组织炎症程度呈正相关。Feng等[27]研究结果显示，CHB患者外周血T淋巴细胞表面PD-1/PD-L1水平与ALT/AST呈正相关系，表PD-1/PD-L1信号通路通过干扰调节T淋巴细胞功能，加速了HBV感染患者病情进展。Xu等[28]通过检测CHB患者外周血PD-1表达水平与患者ALT、AST水平及病毒载量呈正相关，表明PD-1可作为一个潜在反映肝组织损伤和病毒复制水平的指标之一。但也有部分学者认为PD-1与ALT/AST及TBIL等反映肝组织炎症活动指标无明显相关性，仅与T淋巴细胞数量、HBV-DNA载量及HBeAg血清学转换相关[23]。

2.4 PD-1/PD-L1信号通路在CHB抗病毒治疗中的作用

2.4.1 干扰素 干扰素及核苷(酸)类似物(NAs)是目前抗HBV治疗的主要药物。干扰素主要通过介导机体免疫状态，诱导宿主产生细胞因子及抗病毒蛋白，在多个环节上抑制病毒复制，从而增强机体清除病毒能力。核苷(酸)类似物主要作用于HBV聚合酶，取代病毒复制过程中延长聚合酶链所需结构相似的核苷物，从而抑制病毒复制。抗病毒治疗可减少CHB患者外周血细胞表面及肝组织中PD-1的表达，抑制病毒特异性T淋巴细胞的负向调控作用，恢复T淋巴细胞清除病毒功能和增殖活性，减轻肝组织炎症，延缓病情进展。

研究发现，在聚乙二醇α-干扰素抗病毒治疗过程中，随着HBV-DNA载量的下降，CD8+T淋巴细胞表面PD-1表达下调，CD8+T淋巴细胞功能也随之恢复，从而加快HBV清除[29]。梁雪松等[30]研究发现，在聚乙二醇α-干扰素抗HBV治疗12周时，HBV-DNA载量降低，PD-1阳性的CD8+T细胞比例较基线降低；当治疗到12～24周时PD-1阳性CD8+T细胞比例降低，但下降速度减缓，相应病毒载量下降幅度也随之减弱。提示干扰素可下调CD4+T淋巴细胞的免疫活性，增强CD8+T细胞抗病毒功能，减轻免疫损伤。程健等[31]发现，在抗病毒治疗早期，CHB患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞表面的PD-1表达逐渐降低，同时段患者血清中HBV-DNA载量和肝功能损伤指标水平也随之降低，认为抗病毒治疗初期CHB患者外周血T淋巴细胞上PD-1表达变化可作为抗病毒治疗效果和疾病预后的预测指标之一。总之，干扰素治疗可明确调控CHB患者PD-1、PD-L1表达，促进HBV清除和肝组织炎症恢复。

2.4.2 NAs NAs能够快速抑制HBV复制，降低促炎性细胞因子水平，促进肝组织炎症复常。NAs抗病毒治疗过程中，不仅患者体内病毒载量下降，其外周血PD-1、PD-1表达及肝损伤指标(ALT、AST)水平也下降。恩替卡韦(ETV)是目前广泛应用于临床抗HBV DNA治疗的主要核苷酸类药物之一，其能有效抑制对拉米夫定耐药及野生型HBV，具有安全、高效、低耐药性的特点。张玉喜等[32]研究发现，在ETV抗病毒治疗24周，CHB患者外周血单核细胞表面PD-1，PD-L1表达降低，病毒载量显著减少，肝组织炎症复常。同时有研究发现，NAs治疗24周，CHB患者HBV-DMA载量和肝功能较治疗前明显好转，外周血CD4+、CD8+T细胞表面PD-1、PD-L1表达较治疗前下调[33]。有研究通过对35例血清HBeAg阳性的CHB患者抗病毒治疗1年观察发现，期外周血HBV-DNA、ALT及CD4+T、CD8+T细胞表面PD-1表达较治疗前降低。HBeAg血清学转换组PD-1表达、病毒载量及ALT水平较未发生HBeAg血清学转换组下降更显著[34]。可见，NAs抗病毒治疗可下调T细胞表面PD-1、PD-L1表达，促进T淋巴细胞生物学功能恢复，抑制病毒复制，改善病情。阻断PD-1/PD-L1负性协同信号通路对改善患者免疫功能有一定改善作用。

PD-1/PD-L1信号通路在HBV感染引起的免疫损伤反应中发挥重要的调控作用。该信号通路通过上调T淋巴细胞水平调节机体免疫功能，诱导机体免疫耐受，导致病毒感染持续和疾病慢性化。但随着PD-1、PD-L1表达升高也可阻断机体过度的免疫损伤，避免诱发肝衰竭。阻断PD-1/PD-L1信号通路可使T淋巴细胞数量和功能复常，增强其抗病毒能力，其可能也将成为治疗CHB的一个新免疫靶点。PD-1通路抑制剂已在临床应用于肿瘤及自身免疫性疾病的治疗，但尚未用于CHB患者的治疗。在CHB的不同免疫阶段PD-1、PD-L1表达存在差异，因此阻断PD-1/PD-L1信号通路的时机尤其重要。这有待进一步研究。