循环肿瘤DNA检测在胃癌中的应用进展

席小霞，石定

河南中医药大学，郑州450000

胃癌是发病率和病死率极高的恶性肿瘤之一，其发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居恶性肿瘤第3位[1]。胃癌早期缺乏显著的临床特征，大多数患者确诊时已失去最佳治疗时机，从而大大降低了5年生存率及生活质量。因此，胃癌的早期诊疗尤为重要，但临床肿瘤标记物诊断早期胃癌的灵敏度与特异度不高。液体活检是一种利用肿瘤患者体液中的循环生物标志物来提供肿瘤遗传信息的体外诊断技术，主要用于检测和分离循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA(ctDNA)，作为肿瘤患者基因组和蛋白质组信息的来源。ctDNA检测即是液体活检的一种。循环肿瘤DNA不仅可作为诊断胃癌的生物标志物之一，还可用于胃癌基因突变、扩增、甲基化检测以及早期诊断、预后等监测。本文就ctDNA在胃癌中基因检测和临床应用作一综述。

1 ctDNA的生物学特性

循环游离DNA(cfDNA)是由正常细胞和循环肿瘤细胞等凋亡、坏死后释放到血液中的游离DNA，通常与蛋白质结合形成核小体游离于循环中，来源于肿瘤的这部分cfDNA，称为ctDNA。1948年，Mande等[2]首次在人体血液中检测到cfDNA。然而，对cfDNA的了解仅限于它与自身免疫性疾病及慢性炎症的关系，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、肾小球肾炎、胰腺炎、炎症性肠病和肝炎。1977年，Leon等[3]发现，癌症患者循环血浆DNA水平增加。ctDNA是一种以单链或双链DNA的形式存在于动物和人类的血液(血浆或血清)、滑膜液或其他体液中的一种游离DNA，其长度小于180 bp，浓度为3.6～5.0 ng/mL[4]。ctDNA产生的机制目前尚未完全清楚，其在肿瘤患者血液中的增加可能是多种方式共同作用的结果[4,5]。

2 胃癌患者ctDNA检测

ctDNA检测分为定性和定量检测。研究表明，ctDNA与肿瘤内部的DNA具有相同的遗传信息改变如基因突变、肿瘤抑制基因的启动子的高甲基化、微卫星的不稳定性和杂合度的损失[6]。研究发现，ctDNA水平与肿瘤大小、TNM分期密切相关，而与患者总体生存率呈负相关[7]。用qPCR检测术前53例胃癌患者和21例健康对照者的ctDNA水平，结果显示胃癌患者的ctDNA水平高于健康对照组，胃良性肿瘤患者的ctDNA水平与健康患者的ctDNA水平无明显差异[8～10]。

2.1 DNA突变检测 Hamakawa等[10]对含有TP53突变的胃癌患者血浆ctDNA进行大规模平行深度靶向测序，结果发现10例TP53突变患者中有3例术前ctDNA中可检测出TP53突变。Fang等[11]分析了277例原发性胃癌患者血浆ctDNA中8种基因(ARID1A、TP53、PIK3CA、PTEN、AKT3、BRAF、AKT2、AKT1)的突变谱，发现ctDNA中TP53、ARID1A、PI3KCA是胃癌患者最常见的突变基因，且ctDNA高水平的患者比ctDNA低水平的患者更易出现血管侵犯，且患者5年生存率低。

2.2 DNA甲基化检测 研究指出，胃癌患者ctDNA中基因甲基化异常预后较差[12]。Pimson等[13]研究发现，101例晚期胃癌患者中85%～95%患者血浆ctDNA中存在PCDH10和RASSF1A甲基化。Balgkouranidou等[14]对73例Ⅰ～Ⅲ期可手术胃癌患者血浆ctDNA中的RASSF1A和APC甲基化进行分析，结果发现ctDNA中RASSF1A启动子甲基化与临床预后相关性并不大，但术前ctDNA中APC启动子甲基化的患者具有较高的病死率。术前ctDNA中SOX17基因甲基化降低了胃癌患者总体生存率[15]。此外，研究发现术前ctDNA中MINT2启动子异常甲基化与腹膜播散及肿瘤进展相关；TIMP-3甲基化与患者生存率较差相关[16]。有研究对202例胃癌患者术前不同分期及术后随访ctDNA中XAF1的甲基化情况，结果显示XAF1甲基化术后阴性到阳性的变化与较差的无病生存率相关[17]。综上所述，ctDNA中甲基化可预测胃癌的预后。

2.3 DNA扩增检测 表皮生长因子受体2(HER2)是曲妥珠单抗靶向治疗晚期胃癌患者的关键生物标志物。研究表明,HER2基因扩增或HER2蛋白过表达是导致癌症进展的原因，大约20%的晚期胃癌患者存在HER2基因扩增或HER2蛋白过表达[12]。Shoda等[18]用数字液滴PCR(ddPCR)法对胃癌患者ctDNA中HER2表达进行了实时评估，术后随访显示53.84%的患者复发时血浆ctDNA中HER2表达较高，即使手术时诊断为HER2阴性的患者也是如此。因此，通过ddPCR检测ctDNA中HER2表达可为胃癌患者预后评估提供新方向。

3 ctDNA在胃癌诊疗中的应用

3.1 筛查及诊断早期胃癌 目前ctDNA作为筛查手段的最大挑战可能是灵敏度和特异度不高。而近期的一项Meta分析显示，ctDNA诊断胃癌的灵敏度为62%、特异度为95%。但Meta分析中ctDNA的检测方法、基因靶点、患者种族等存在明显异质性，需进一步研究以阐明ctDNA在胃癌中的诊断价值[19]。目前的证据显示，ctDNA的灵敏度并不高于传统的蛋白标志物(癌胚抗原、癌抗原125、癌抗原724等)，ctDNA与传统蛋白标志物结合诊断的灵敏度为60%～75%[20]。

3.2 预测胃癌预后 Survivin可抑制细胞凋亡。胃癌液体活检显示，ctDNA中Survivin的表达可独立预测患者的生存期，但只有细胞质表达的Survivin对总生存率有显著影响，而细胞核表达的Survivin对预后无影响[21]。Cao等[22]进一步研究发现，患者术后血浆ctDNA中Survivin mRNA的表达与肿瘤大小、淋巴结转移及高分化有关。此外，Rawnaq等[23]对92例胃肠道肿瘤复发的患者血浆ctDNA进行检测，结果显示微卫星DNA杂合性丢失与肿瘤复发存在一定的关联，但与总生存期无关。研究指出ctDNA中膜1型基质金属蛋白酶可作为预测胃癌复发和远处转移的预后指标[24]。晚期胃癌患者血液ctDNA中程序性死亡-配体1(PD-L1)mRNA表达高于早期胃癌患者，且PD-L1表达与肿瘤的浸润深度、转移程度及分期有相关性[25]。

3.3 监测胃癌的耐药 ctDNA可实时反映肿瘤组织的当前状态，故可定性定量检测ctDNA表达来分析药物的疗效。克唑替尼可有效治疗原癌基因，受体酪氨酸激酶(MET)扩增性胃癌，但部分患者仍产生耐药。Lennerz等[9]通过新一代测序对Ⅳ期胃癌患者ctDNA中的MET、FGFR2基因进行定期突变分析，结果提示ctDNA中MET的反复扩增和继发性突变、FGFR2基因的相对拷贝数增加及下游相关元件的突变等是胃癌产生耐药的主要原因。40%～50%的胃癌患者ctDNA中存在HER2和(或)表皮生长因子受体(EGFR)的共扩增，可能驱动产生新的耐药性[26]。有研究采用靶向捕获测序分析了39例早期胃癌患者中的173个连续ctDNA样品，用来分析曲妥珠单抗耐药机制，结果发现早期胃癌患者中的耐药基因为EGFR和CNV[27]。因此，ctDNA用于胃癌耐药性的监测。

3.4 监测胃癌术后复发 ctDNA可作为监测残留肿瘤复发的生物标志物。Kim等[28]采用全基因组测序对25例术后胃癌患者ctDNA进行个体化肿瘤特异度重排分析，结果显示19例患者中发现肿瘤特异度重排；除此之外，胃癌患者术前ctDNA阳性与术后12个月内胃癌复发显著相关，提示术后ctDNA监测对预测胃癌患者复发有重要意义。胃癌术后ctDNA持续高水平预示复发的可能[29]。但也有研究表明，胃癌复发患者其术后ctDNA阴性，因此ctDNA并不能作为胃癌复发的生物标志物[30]。因此，仍需更多的研究进一步证实ctDNA在胃癌术后复发中的作用。

ctDNA为胃癌的基因检测、早期诊断、生存预后、耐药监测、术后复发监测等方面开辟了新的视角。但目前国内外研究仍停留在小范围样本监测上。因此，仍需更多前瞻性、多中心、大样本的研究验证ctDNA在胃癌发生发展中的应用价值。虽然目前ctDNA在临床中的应用有限，但具有通用性，其有可能成为肿瘤诊断及预后预测的指标之一。