明月草组培快繁技术体系的建立

杨利平，时 群，陈丽文，杨 琼，李芳菲，程 愫

（1.钦州市林业科学研究所，广西 钦州 535099；2.广西财经学院，南宁 530003）

明月草（Angelica keiskei Koidzumi）又称茎叶天葵，属菊科菊三七属（Gyunra），产自云南、贵州等地，印度、尼泊尔、缅甸、泰国也有分布［1］。明月草株高30～40 cm，直根系，主根肉质，侧根多，茎直立，肉质、基部紫色带绿，嫩茎浅绿色、具浅棱，被短柔毛或无毛，分枝力强，叶为单叶，互生，椭圆形或卵圆形，长10～12 cm，宽4～6 cm，边缘有粗锯齿，叶面绿色，叶背浅绿色，为宿根多年生长常绿直立草本植物。该物种含有多种天然活性物质，特别是富含特有物质查尔酮及香豆素，全草可入药，具有增强人体免疫力、舒张血管、抑制胃酸分泌、抗血栓、降血糖、降血压、抗组胺、防癌变等功效［2-5］。近年来，明月草又成为人们喜爱的一种蔬菜，主要食用茎叶，食法多样，可炒食、炸食、凉拌、氽汤或做成茶汁，其具有独特的芳香，可解鱼、肉的腥膻味，茎叶煮水后食味柔滑，口感清爽［6，7］。

明月草以播种、分株或扦插繁殖方式为主，多在3～5 月进行，但受季节影响较大，且繁殖系数和出苗率低，难以满足规模化生产需求［1，3］。组织培养繁殖速度快，所产种苗为脱毒苗，但国内利用组织培养技术繁育明月草的研究尚未见报道。本研究采用组织培养技术建立了明月草的组织培养再生体系，实现对明月草的规模化繁殖，并提供了一套高效的产业化栽培技术，为规模化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

选取由钦州市林业科学研究所培育的2 年生且生长健壮、无病虫害的明月草作为母株，剪取带腋芽嫩枝作为外植体。

1.2 方法

1.2.1 外植体的消毒 选取带腋芽的嫩枝，去除叶片，先用自来水冲洗干净，再用洗洁精清洗1 遍，然后用自来水冲洗4～5 遍，置于超净工作台上保留带腋芽的茎段2～3 cm，切除其余茎段，设置为7 组处理，分别用0.1% HgCl2浸泡6、8、10 min；用75%C2H5OH 浸泡20、30、40 s，及75% C2H5OH 与0.1%HgCl2组合处理1 组（表1），每组处理设置30 个重复，每个处理接种1 条茎段，消毒后再用无菌水冲洗4 次，备用。外植体诱导培养基选用MS+0.20 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，同时附加30.0 g/L 蔗糖和3.6 g/L 琼脂粉，pH 5.8。培养条件（下同）：培养温度为（25±2）℃；光照度2 000～2 500 lx，光照时间为12 h/d。每隔3 d 观察记录1 次。

表1 明月草外植体消毒处理的设置

1.2.2 芽的诱导 将消毒好的茎段两端各切除一部分，切成长1.5～2.0 cm，保留1 个节位，接入以MS 为基础培养基，添加5 个梯度浓度的6-BA（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L）和3 个梯度浓度的NAA（0、0.05、0.10 mg/L）组合的5 组培养基中，选用未添加任何激素的空白MS 培养基为对照，每种诱导培养基接种30 个外植体。诱导培养基附加30.0 g/L 蔗糖和3.6 g/L 琼脂粉，pH 5.8。每隔3 d 观察1 次芽的萌动情况和生长情况，待培养至18 d 统计芽诱导率。

污染率=污染的外植体数/接种外植体数×100%；萌芽率= 萌发的外植体数/接种外植体数×100%；

有效芽率=萌发且未污染的外植体数/萌发的外植体数×100%。

1.2.3 增殖培养 待芽萌发至1.5 cm 左右时，切下接入以MS 为基础培养基，并含有不同浓度6-BA和NAA 组合的培养基中（表2），同时设置空白对照，每个组合接种30 个外植体，进行增殖培养。每3 d 观察1 次，培养15 d 后统计不同激素组合培养基对芽增殖和生长的影响，计算芽增殖系数。

增殖系数=增殖芽总数/接种芽总数。

表2 6 种不同激素种类及浓度增殖培养基组合

1.2.4 根的诱导 将生长至2.0 cm 左右的芽从丛生芽上切下，将单芽转至以1/2MS 为基础培养基，含有不同浓度IBA 和NAA 的生根培养基中，培养10 d 后调查生根情况，并记录数据。

1.2.5 移栽管理 将长势良好、生根较好的瓶苗炼苗2～3 d，移栽至装有黄心土的薄膜袋中或泥炭土∶珍珠岩=4∶1 的穴盘中，在75% 遮阴度的温室大棚中培养20 d 后观察生长状况和成活率。

1.3 试验设计及统计方法

各组试验均采用单因素完全随机设计，对照均采用未添加任何植物生长调节剂的MS 空白培养基，每个处理设置30 个重复。运用DPS 15.1 软件进行数据处理，LSD 法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 外植体不同消毒剂处理的差异比较

消毒是植物组织培养过程中的重要环节，本研究采用不同消毒方式探究最适宜明月草外植体消毒的方式。从表3 可以看出，分别采用0.1% HgCl2和75% C2H5OH 作为消毒剂，随着0.1% HgCl2和75%C2H5OH 消毒时间的延长，可以有效降低外植体污染率，单一使用0.1% HgCl2消毒10 min 可以达到理想消毒效果，污染率控制在13.3%，萌芽率可达到83.3%，有效芽率达到96.0%。采用0.1% HgCl2和75% C2H5OH 两步消毒，污染率可以得到较好的控制，但部分外植体失去萌发活力，有效芽较低。因此，最佳的消毒方式应采用单一0.1% HgCl2消毒10 min。

表3 不同消毒方式对明月草消毒效果的影响

2.2 不同激素配比对明月草芽诱导的影响

不同种类及浓度植物生长调节剂组合对明月草丛生芽诱导效果的对比试验表明，随着6-BA 浓度的增加，增殖系数有所提高，芽的初始萌动时间有不断缩短趋势，处理5 的培养基组合MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 与处理6 的培养基组合MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 效果最佳，增殖系数分别是3.34、3.36，均显著高于其他培养基组合，综合诱导效果和成本两个方面，优选培养基组合MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 作为明月草的芽诱导培养基（表4），芽诱导效果见图1。

表4 不同激素组合对明月草芽诱导的影响

图1 明月草芽诱导培养

2.3 明月草最佳继代增殖培养基的筛选

由表5 可知，在培养基中添加不同种类和浓度组合的激素后，明月草继代增殖效果表现出一定差异，均优于空白对照组。供试培养基组合中，增殖效果最佳的一组（M6）增殖系数达到3.39，但该处理芽的生长状态表现出细弱，长势不佳；处理M5的增殖系数为3.22，显著高于除了M6以外的其他组合。在培养基中添加0.20 mg/L 的腺嘌呤在一定程度上有助于促进芽的增殖；在继代增殖阶段，当6-BA 浓度达到0.80 mg/L 以上时不利于芽的生长。综上所述，最适宜用做明月草继代增殖的培养基组合为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.20 mg/L AD，增殖效果见图2。

图2 明月草增殖培养

2.4 不同浓度IBA 和NAA 组合对明月草组培苗生根诱导的差异比较

如表6 所示，处理2、处理3 及处理6 的培养基组合根诱导率均达到了100%；平均生根数最多的组合为处理2 及处理6，平均生根条数分别达到了7.40 条/株和7.70 条/株，且较其他处理达到了显著性差异；从平均根长来看，处理2 和处理6 的生根效果最好，分别为4.90 和5.18 mm。综合根诱导率、生根数量及根长3 个指标，最适宜明月草生根培养的培养基为1/2MS+0.40 mg/L NAA，其次为1/2MS+0.50 mg/L IBA，单一使用IBA 或NAA 的生根效果优于二者组合，生根培养见图3。

表5 不同激素配比组合对明月草继代增殖效果的影响

表6 不同浓度IBA 和NAA 组合对明月草组培苗生根诱导的差异比较

图3 明月草生根培养

2.5 明月草试管苗的移栽及管理

明月草适于生长在疏松透气、持水保肥性好的基质中，可选择泥炭土与珍珠岩（4∶1）的基质作为移栽基质，亦可选用黄心土作为移栽基质，移栽前1 d需用0.1%KMnO4对基质进行消毒处理，移栽后浇透定根水，并用遮阳网覆盖，或选用具有一定遮阴效果和通风条件的育苗棚。明月草生根瓶苗培养2 周左右，当生根条数达到6 条以上，平均根长在0.5 cm左右时便可炼苗3 d，然后用清水将根部琼脂清洗干净进行移栽。生根苗移栽后用清水淋透，移栽20 d后调查成活率。移栽试验显示，只要移栽时明月草的根系健壮，植株健康，管理得当，成活率可达到98% 以上（图4）。明月草虽然感病性不强，但还是要预防为主，移栽后每隔2 周喷施适量1 000 倍多菌灵稀释液，连续喷2～3 次。另外，因明月草生长迅速，需肥量大，可采用含氮、钾较高、磷略少的全元控释肥补充其肥分需求，当植株长至一定高度及时换盆。

图4 移栽20 d 后的明月草组培苗

3 结论

目前中国乃至国际上对明月草的研究主要集中在其营养成分分析、有效成分的提取方法以及有效成分的药理作用等方面，如李玲等［8］、尹伟等［9］、程蕾等［10］对明月草叶片中黄酮类化合物的提取工艺及抗氧化活性进行的研究分析表明，明月草中提取的黄酮类化合物具有还原和清除DPPH 自由基和超氧阴离子的能力；还有研究报道了明月草的食用价值及其有效成分的医用价值［11-13］。而现有的研究中对明月草繁育技术及栽培技术的研究尚少。袁志章等［1］、陈奎礼等［4］对明月草的扦插繁育技术进行了研究，并得出不同类型枝条扦插生根率的差异，最高的为86.6%；同时还阐明了氮、磷、钾、钙、镁、铁元素的缺失对明月草生长的影响。本研究主要运用植物组培快繁技术建立了明月草的快速繁殖体系，该体系为提升明月草优质种苗繁育技术及进一步开发利用其有效成分提供了研究基础。

研究表明，使用0.1% HgCl2消毒10 min 可以达到理想消毒效果，污染率控制在13.3%，萌芽率可达到83.3%，萌发的有效芽达到96.0%。培养基MS+0.80 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA 与MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 作为明月草的启动培养基，均可以达到理想的效果，但生产中可结合生产成本核算择优选择；最适宜用做明月草继代增殖的培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA+0.20 mg/L AD，增殖系数分别是3.39，在培养基中添加0.20 mg/L 的腺嘌呤在一定程度上有助于促进芽的增殖；选用1/2 MS 培养基时，单一使用IBA 或NAA 的生根效果优于二者组合，且生根数及平均根长均优于其他处理组合；当NAA 浓度为0.4 mg/L 时，培养10 d，生根率可达到100%，而使用浓度为0.5 mg/L 的IBA亦可达到理想的生根效果，两组之间不存在显著差异。试验中发现选用泥炭土与珍珠岩（4∶1）或黄心土作为移栽基质，均可达到理想的移栽效果，但综合考虑生产成本，建议选用黄心土作为移栽基质。用黄心土作为移栽基质，在保证明月草组培苗根系完整的情况下，20 d 后调查成活率可达98% 以上。