凤头姜组培快繁体系研究

叶兴枝，程 群，张等宏，徐 怡，陈巧玲，陈火云

（湖北恩施中国南方马铃薯研究中心/恩施土家族苗族自治州农业科学院，湖北 恩施 445000）

生姜（Zingiber officinale Roscoe）为姜科姜属多年生宿根植物，有健脾开胃、温中止呕、止咳祛痰、提神活血之功能，有祛寒御湿、延缓衰老、防癌美容之功效，还可提取姜油酮、姜油、香精等医药化工用品［1］。近年来以生姜为原料的保鲜生姜及生姜加工制品大量出口日本及东南亚诸国，成为中国出口创汇的重要产品。

凤头姜块根肥脆，白嫩的块根紧连成扇形，顶上还有点点红蒂，像传说中凤凰的头，因此得名凤头姜，其鲜子姜无筋脆嫩、富硒多汁、辛辣适中、美味可口，远销东南亚市场。

由于凤头姜不易开花结实，不能利用有性繁殖进行大批量育种，生产上长期以成熟根状茎为种源进行无性繁殖，其繁殖系数低、多种病毒积累，造成种性退化、产量降低、品质下降［2］。目前国内外对生姜病毒的防治仍没有特效药，加之多年来生姜品种得不到更新改良，致使凤头姜极易感染多种病毒，阻碍了凤头姜产业的发展。本试验旨在研究凤头姜的组培快繁技术，切实解决阻碍凤头姜产业发展的瓶颈问题，推动凤头姜产业快速发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用无病虫害、块大、粗壮、皮色鲜艳的凤头姜，洗去泥土，用50% 多菌灵800 倍稀释液浸泡15 min，晾干。

1.2 方法

1.2.1 催芽 将处理后的种姜置于消过毒的沙盘中，用细砂覆盖，喷水至细沙湿润（切勿积水），然后将消毒盘置于人工培养箱内催芽。

1.2.2 茎尖剥离 待种姜芽点萌发至1～2 cm 时，选取粗壮的芽，用解剖刀切下，放入器皿中流水冲洗30 min，然后转入超净工作台进行操作。将其放入无菌烧杯内，用75% 乙醇清洗30 s，0.1% HgCl2浸泡15～20 s，5% 次氯酸钠浸泡8～10 min，无菌水冲洗2～3 次。再将其放在无菌滤纸上吸干水分，在解剖镜下剥取带1 个叶原基的茎尖，接种于脱分化培养基上，每瓶接种1 个茎尖。

1.2.3 离体培养

1）脱分化培养。将茎尖接种于脱分化培养基中，记录接种5 周后愈伤组织形成情况及出愈率，筛选最佳培养基。

2）再分化培养。当茎尖明显伸长，叶原基形成可见小叶时，接种于再分化培养基中，观察记录出芽时间，统计出芽率及成活率，筛选最佳培养基。

3）生根壮苗培养。当丛生芽生长至4～5 cm 时，取出整株并将其分割成带有1～2 个小芽，保留基部，留茎1～2 cm，接种于生根壮苗培养基中。观察生根及芽分蘖情况，统计生根率、成苗率及增殖倍数，筛选最佳培养基。

以上所有培养基均以MS 培养基为基础，添加不同激素，pH 5.8，其中成活指茎尖发育为可见的绿点，成活率为成活茎尖个数与接种茎尖个数之比；成苗指成活茎尖长出带有两个以上叶片的小植株，成苗率为成苗茎尖个数与接种茎尖个数之比［3］。增殖系数为增殖后芽苗总数与接种茎尖个数之比。脱毒率为成苗茎尖中经病毒检测后不带病毒的茎尖个数与成苗茎尖个数之比。

1.2.4 培养条件 温度（25±2）℃，光照度2 000～3 000 lx，光照时间14～16 h/d，相对湿度70%～80%。

1.2.5 病毒检测 每个株系随机抽取1%～2% 生长健壮的苗进行检测，检测对象为烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV），确定不带病毒（或不带主要危害病毒）才能用于大量扩繁。

1.2.6 脱毒苗继代培养 经病毒检测确定不带毒的试管苗，去掉根及老叶，分割成带有1～2 个小芽，保留基部，留取1～2 cm 茎段，接种于生根壮苗培养基中扩繁。

2 结果与分析

2.1 不同激素对愈伤组织的影响

在MS 培养基中添加不同浓度6-BA、NAA 和有机成分，接种培养5 周后，①、②、④和⑤号脱分化培养基所诱导的愈伤组织结构紧密，质量较好，成活率均高于90%；③号脱分化培养基所诱导的愈伤组织松散，出愈率和成活率均明显低于其他4 种培养基。结果表明，6-BA 与NAA 配合使用能诱导出高质量的愈伤组织，能明显提高茎尖的成活率；有机成分对愈伤组织的形成及成活率的作用不明显。当NAA 为0.1 mg/L 时，适当调整6-BA 浓度，能明显影响茎尖的出愈率（表1）。经过多次比较试验，综合成本因素，确定①号脱分化培养基是诱导凤头姜茎尖愈伤组织形成的最好配方。

表1 不同培养基对愈伤组织的影响

2.2 不同激素浓度对幼芽分化的影响

将茎尖分化的愈伤组织分别接种到2 种再分化培养基上，经过5 周培养，①号再分化培养基中愈伤组织分化的丛生芽纤细，茎叶淡黄，将纤细丛生芽分割后再次接种于相同培养基，经过5 周培养，分化出的丛生芽仍然纤细；②号再分化培养基中愈伤组织形成的丛生芽多，苗粗壮，茎叶翠绿。②号再分化培养基丛生芽的出芽时间比①号培养基早6 d，出芽率也明显高于①号培养基（表2），经过反复验证，②号再分化培养基是诱导凤头姜丛生芽形成的最好配方。

2.3 不同浓度激素对试管苗生根的影响

凤头姜试管苗很容易生根，但在不同培养基上生根数量、粗细、长度及芽分蘖有所不同。只有在激素浓度适宜的MS 培养基上才能实现根系快速生长，而且根系粗壮，生根多，分蘖也多。由表3 可以看出，生根数及繁殖系数随着6-BA 和NAA 浓度配比适当增加而增加，但对生根率和成苗率的影响不大。以MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.3 mg/L）为培养基对生根及繁殖系数的作用最大。

表2 不同培养基对出芽及成活率的影响

表3 不同培养基对生根的影响

3 讨论

近年来，对生姜组培快繁技术的研究报道日益增多，茎尖培养是目前使用最广泛的脱毒方法［4-8］。培养基配方、茎尖大小、病毒种类及培养条件等均能制约生姜的茎尖脱毒效果，其中最为关键的是培养基成分与浓度的选配［9-13］。基因型不同对培养基的需求有所不同，只有选用适合的培养基，才能培育出高质量的凤头姜脱毒种苗。本研究发现，加入6-BA 的脱分化培养基的茎尖出愈率及成活率明显高于未添加的，一定浓度的6-BA 和NAA 配合使用能诱导愈伤组织形成［14-17］；NAA 能促进细胞伸长生长、细胞分裂及生根，但是浓度超过0.3 mg/L，根的生长速度反而下降［18-20］。本试验构建的凤头姜快繁体系不仅提高了凤头姜组培苗的成活率和脱毒率，还快速提升了凤头姜的繁殖系数。