利用秸秆制备生化富里酸工艺与优化

高希龙，韩梦琪，黄明慧，张倩茹，李 华，罗 星

（中国农业大学烟台研究院，山东 烟台 264003）

中国拥有十分丰富的秸秆资源［1］，据统计，中国每年农作物秸秆资源达6 亿多吨［2］。山东省作为农业大省，年均农作物秸秆可收集量达4 600 万t［3］，其中小麦秸秆可收集量占近1/2［4］。花生作为山东省特别是烟台市地区特色经济作物，种植面积达12万hm2以上，产量达40 万t［5］。秸秆是一种具有多用途的生物资源，含有纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、脂肪和灰分等有机物质及氮、磷、钾、钙、镁和硅等矿质元素［6］。花生秸秆中富含有机质、氮、磷、钾等营养元素［7］，花生红衣中还含有多种多酚物质［8］。传统的秸秆利用方式大多是能源化利用［6］，有少部分用于饲料［9］。

生化富里酸是一类成分复杂的天然有机物［10］，具有分子量较小、水溶性高、活性成分含量高等特点［11］，能够增强农作物的抗病能力，提高农作物品质［12］。本研究以小麦秸秆、花生秸秆、花生红衣为原料，利用发酵法生产生化富里酸，通过单因素法探究生产生化富里酸的最佳工艺，以期为生化富里酸工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦秸秆、花生秸秆，取自中国农业大学烟台研究院试验基地；花生红衣，取自牟平长生奶牛场；发酵菌（混合堆肥发酵菌），由文登海龙养殖场提供；红糖、玉米淀粉，均为市售；生化富里酸标准品，购自麦克林公司。

1.2 仪器与药品

pH 计（BPH-200D 型），购自贝尔分析仪器有限公司；恒温培养箱（DNP-9272），购自精宏公司；分析天平（MS-TS），购自梅特勒-托利多公司；水浴恒温振荡器（SHA-B），购自常州亿通分析仪器制造公司；恒温干燥箱（DZF-6030），购自苏州纳美瑞科技有限公司；循环抽滤泵（SHZ-III），购自上海知信公司；高温电阻炉（SX-2.5-10），购自林茂科技有限公司；粉碎机，购自新加特公司；分光光度计（752N），购自上海仪电公司。

氢氧化钠、硼酸、溴甲酚绿、甲基红、乙醇、浓硫酸、硫酸亚铁、凡士林、碳酸氢钠、盐酸、钼酸铵、抗坏血酸、磷酸二氢钾、碳酸钙、丙酮、尿素等均为分析纯，购自烟台健硕化工有限公司；去离子水为实验室自制。

1.3 方法

1.3.1 生化富里酸的测定 采用容量法测定样品中的生化富里酸产量［13］。容量法是用焦磷酸钠溶液从样品中抽提出生化富里酸，在强酸溶液中用过量K2Cr2O7溶液，将腐植酸中的C 氧化成CO2，然后用FeSO4标准溶液滴定过量的K2Cr2O7，根据K2Cr2O7消耗量和生化富里酸的含C 比，计算出样品中生化富里酸的产量，具体测定方法如下。

准确称取待测样品0.200 0～0.500 0 g（精确到0.000 1 g），放入250 mL 锥形瓶中。加入焦磷酸钠溶液100 mL，置于沸水浴中加热抽提2 h，取出，定容至250 mL 容量瓶中（V），准确移取10 mL 于250 mL锥形瓶中，加入5 mL K2Cr2O7溶液，于沸水浴中加热氧化30 min。将氧化后的溶液取下，冷却至室温，分别加入约70 mL 水、3 滴1，10-菲洛琳-硫酸亚铁铵混合指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液由橙色经绿色变为砖红色即为滴定终点。计算公式如下：

式中，0.003 为碳质量系数（g）；V0为空白体积；V3为待测液滴定体积；CFe2+为硫酸亚铁铵标准溶液浓度；V 为待测液定容体积；k 为生化富里酸的碳系数；m 为待测样品质量；V1为待测液体积；V2为移取体积。

1.3.2 秸秆预处理 小麦秸秆、花生秸秆、花生红衣用烘干法测量含水率，灼烧法测定灰分含量。恒温干燥箱105 ℃烘干后粉碎，过40 目筛，密封后放入冰箱，4 ℃保存。由表1 可知，花生秸秆灰分含量最高，为6.89%，小麦秸秆的粗纤维含量最高，为37.00%，花生秸秆与花生红衣的含氮量较高。

表1 秸秆理化指标 （单位：%）

1.3.3 原料发酵 取一定量的小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆放入发酵桶中，加入适量红糖、淀粉、尿素、发酵菌，用去离子水调节含水率为60.00%，放入培养箱中调节不同温度进行发酵，检测生化富里酸产量的变化。

1.3.4 生化富里酸提取 将发酵料中加入一定比例的水，用挤压法提取发酵液，用氢氧化钠、浓盐酸调节pH，静置1 h，4 000 r/min 离心15 min，得生化富里酸精制液。用旋转蒸发仪对精制液进行浓缩，60～70 ℃烘干，得生化富里酸精粉。

1.3.5 数据处理 利用Excel 软件对得到的试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同种类秸秆对生化富里酸产量的影响

发酵过程是一个利用微生物降解大分子有机物的生物化学过程，不同种类的秸秆成分不同［14］，制备的生化富里酸产量有差异。将小麦秸秆、花生红衣、花生秸秆、小麦秸秆∶花生秸秆=1∶1 的混合秸秆在培养箱中40 ℃发酵240 h，每隔24 h 取样检测生化富里酸的产量变化，结果见表2。由表2 可知，发酵初期微生物活性大，生化富里酸产量增加较快。发酵120 h 后生化富里酸产量增加变慢，216 h 达到最大，之后变化不大。其中，混合秸秆的生化富里酸产量显著高于其他秸秆，达74.38 g/kg。说明混合秸秆综合了小麦秸秆与花生秸秆2 种秸秆的原料优点。

表2 不同秸秆发酵过程中生化富里酸的产量变化

2.2 不同配比小麦秸秆与花生秸秆混合物对生化富里酸产量的影响

小麦秸秆与花生秸秆以质量比2∶1、1∶1、1∶2 混合进行发酵，检测发酵216 h 时生化富里酸产量。由图1 可见，小麦秸秆与花生秸秆质量比为2∶1 混合后发酵，生化富里酸产量显著高于其他两组。

图1 不同配比小麦秸秆与花生秸秆混合物对生化富里酸产量的影响

2.3 不同发酵温度对生化富里酸产量的影响

温度影响发酵菌的活性，适宜的温度能提高生化富里酸的产量。将混合秸秆原料分别在25、30、35、40、45 ℃的温度下进行发酵，发酵216 h 时检测生化富里酸产量。由图2 可知，不同温度下发酵出的生化富里酸产量差异较大，在温度为35 ℃下发酵的生化富里酸产量达87.50 g/kg，显著高于其他温度下的发酵产量。

图2 不同发酵温度对生化富里酸产量的影响

2.4 不同添加剂对生化富里酸产量的影响

有研究表明，在发酵过程中，采用人工接菌的方式比自然发酵更有利于发酵底物的生物降解，促进生化富里酸的生成［15］。添加氮源时应考虑氮源的水溶性以及成本要素，经过借鉴相似研究并结合实验室条件，本研究确定选取尿素作为氮源［16］。秸秆中氮含量较低，用尿素补充氮源，添加菌剂能迅速形成优势菌群，有利于发酵的快速高效进行。以混合秸秆为原料，添加不同量的尿素和菌剂，添加剂加入量如表3 所示。将添加不同量尿素和菌剂的各组分别在35 ℃下发酵216 h，检测生化富里酸产量（图3）。由图3 可知，第5 组和第6 组具有较高的生化富里酸产量，说明尿素添加量较低时氮源不足，不利于发酵，当尿素添加量达2% 时显著促进了发酵；菌剂的加入能促进发酵，加入3% 菌剂促进效果显著，过多加入又会抑制发酵。因此尿素和菌剂添加2%和3% 时具有较好的生化富里酸产量。

表3 各组尿素含量与接种量处理水平 （单位：%）

图3 不同添加剂对生化富里酸产量的影响

3 小结与讨论

本研究以小麦秸秆、花生秸秆、花生红衣为原料发酵生产生化富里酸，通过单因素试验探索制备最佳工艺，得到以下结论：①混合秸秆比单一秸秆制备效果好，其中小麦秸秆和花生秸秆按照质量比2∶1混合后发酵具有较高的生化富里酸产量；②发酵过程中要严格控制条件，35 ℃发酵216 h，生化富里酸产量最高；③添加剂对发酵影响较大，添加适量的尿素和发酵菌剂有助于提高生化富里酸产量。

利用农作物秸秆为原料生产生化富里酸是秸秆高附加值利用的全新探索。产出的生化富里酸水溶性好，生物活性强。在土壤改良方面，能够有效降低土壤容重，增强透气性，有利于耕作［17］；在提高作物抗逆性方面，外源生化富里酸处理的作物可改善盐胁迫下作物的光合作用，缓解盐胁迫对作物的危害［18］；在肥料生产方面，生化富里酸可以充当复合材料、功能材料、抗逆材料［19］。可见通过秸秆发酵制备生化富里酸有助于促进高效生态农业、绿色农业的发展，尽快实现向可持续发展的循环型农业转型［20］。本研究旨在为生产生化富里酸提供新途径，同时也为其他方法制备生化富里酸提供参考。