血清微小RNA-106b-5p、RNA-30a-5p水平与结直肠癌患者预后的关系及其诊断价值

张煌，鲁恒珍，周帅跃，郑华理，朱爱萍

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤，发病率和病死率仅次于胃癌，严重威胁人民身体健康及生命安全。近年来，受饮食结构、生活方式改变等诸多因素影响，我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势[1]。结直肠癌早期发病症状隐匿，不易被察觉，大多数患者就诊时已处于中晚期并伴有远处转移，错过了最佳手术治疗时机，导致患者5年生存率低、预后差[2]。寻找有效的辅助预测结直肠癌预后并具有诊断价值的血清标志物，对提高患者生存率、改善患者预后具有积极意义。微小RNA(microRNA，miR)是一类高度保守的非编码小RNA，参与调节多种生理过程。因其在血液、尿液及脑脊液等体液中的稳定性较好，miR已被证实具有成为多种疾病血清生物标志物的潜能，也是目前肿瘤研究领域的热点[3]。miR-106b-5p具有调控肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移等功能[4]；miR-30a-5p与多种恶性肿瘤发生发展密切相关[5]，可能通过多种途径发挥抑癌功能，但miR-106b-5p、miR-30a-5p在结直肠癌中的意义尚不十分明确。现分析结直肠癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p检测的应用价值，为临床提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月—2014年12月安徽省安庆市第一人民医院肿瘤科手术治疗的结直肠癌患者(结直肠癌组)、门诊确诊的结直肠腺瘤患者(结直肠腺瘤组)和同期健康体检者(健康对照组)作为研究对象，各90例。结直肠癌组男53例，女37例，年龄42～73(45.13±7.58)岁，≤60岁56例，>60岁34例；肿瘤直径：<5 cm 46例，≥5 cm 44例；肿瘤分化程度：中高分化 60例，低分化30例；肿瘤浸润深度：T1+T2 57例，T3+T4 33例；有淋巴结转移49例，无淋巴结转移41例；有远处转移患者57例，无远处转移患者33例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期65例，Ⅲ+Ⅳ期25例。结直肠腺瘤组男49例，女41例，年龄41～74(44.98±6.95)岁，≤60岁54例，>60岁36例；患者均无恶性肿瘤、家族性息肉病及溃疡性结肠炎等结直肠疾病。健康对照组男54例，女36例，年龄43～75(45.64±6.73)岁，≤60岁52例，>60岁38例；纳入健康体检者均无恶性肿瘤、肝肾疾病及其他严重疾病史。3组研究对象的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会核准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①完整的病历资料及术后随访资料；②术后经病理组织学确诊；③卡氏(Karnofsky)评分≥70分。(2)排除标准：①结直肠癌复发病例；②合并家族性腺瘤性息肉病；③合并胃癌等其他恶性肿瘤；④合并免疫系统、血液系统等疾病；⑤合并糖尿病等慢性疾病。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 样本采集： 结直肠癌组于术前1天、结直肠腺瘤组于确诊后次日、健康对照组于体检时，抽取所有研究对象的空腹外周静脉血5 ml，在4℃时离心收集上层血清，置于-80℃冰箱保存备用。

1.3.2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达检测：血清样本中加入cel-miR-39(终浓度500 fmol/ml，购自美国ABI公司)，RNA提取试剂盒(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)提取血清总RNA，微量紫外分光光度计(Nanodrop 1000，美国赛默飞世尔科技公司)检测RNA浓度及纯度，TaqMan miR逆转录试剂盒(美国ABI公司)进行逆转录反应，miRNA特异性TaqMan miR试剂盒(美国ABI公司)，7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行TaqMan real-time PCR检测；每个样本设置3个复孔，采用2-△△Ct计算miRNA相对表达量。引物序列(由上海生工生物工程股份有限公司设计)如下，miR-106b-5p正向引物5’-TGCGGCAACACCAGTCGA TGG-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；miR-30a-5p正向引物5’-CACTCTCATGTAAACATCCTCGAC-3’，miR-30a-5p反向引物5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTGTC-3’；正向引物5’-CAGAGTCACCGGGTGTAAAT，内参cel-miR-39反向引物5’-CCAGTGCGTGTCGTGGAGTC-3’。

2 结 果

2.1 3组血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平比较 血清miR-106b-5p相对表达量比较，结直肠癌组>结直肠腺瘤组>健康对照组(P均<0.01)；血清miR-30a-5p相对表达量比较，结直肠癌组<结直肠腺瘤组<健康对照组(P均<0.01)，见表1。

表1 3组血清miR-106b-5p、miR-30a-5p相对表达水平比较

2.2 结直肠癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平在不同临床病理特征中比较 结直肠癌患者血清miR-106b-5p水平在不同性别、年龄、肿瘤位置、分化程度及浸润深度方面比较，差异无统计学意义

(P均>0.05)，而在不同肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移及临床分期方面比较，差异有统计学意义(P均<0.05)；结直肠癌患者血清miR-30a-5p水平在不同性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径及远处转移方面比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，而在不同肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期方面比较，差异有统计学意义(P均<0.05)，见表2。

2.3 结直肠癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平在不同预后情况中比较 以血清miR-106b-5p中位数(4.64)、miR-30a-5p中位数(0.39)分别为界，将结直肠癌患者分为高表达亚组(45例)和 低表达亚组(45例)，Kaplan-Meier结果显示，血清miR-106b-5p高表达亚组患者术后5年总生存率为22.22%(10/45)，中位生存时间为(35.24±2.98)个月，低表达亚组为64.44%(29/45)，中位生存时间为(44.47±3.19)个月，2亚组比较差异有统计学意义(χ2=11.449，P=0.001)，见图1。血清miR-30a-5p高表达亚组患者术后5年总生存率为60.00%(27/45)，中位生存时间为(31.36±3.06)个月，低表达亚组为26.67%(12/45)，中位生存时间为(46.89±2.75)个月，2亚组比较差异有统计学意义(χ2=12.613，P=0.000)，见图1。

2.4 结直肠癌患者血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平与预后的相关性 结直肠癌患者血清miR-106b-5p与患者预后呈负相关(r=-0.429，P=0.039), 血清miR-30a-5p表达水平与患者预后呈正相关(r=0.458，P=0.041)。

表2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平在不同临床病理特征中比较

2.5 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平诊断结直肠癌的价值 ROC分析结果显示，miR-106b-5p、miR-30a-5p诊断结直肠癌的cut-off值分别为4.52、0.39，AUC为0.785、0.692、0.824，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p联合检测对结直肠癌的诊断价值较大，AUC为0.824，见表3，图2。

3 讨 论

越来越多的研究发现，结直肠癌组织和细胞中存在异常表达的miR分子，如高表达的miR-19a-3p和低表达的miR-874[6-7]，miR可通过转录后调控机制影响结直肠癌细胞的增殖、浸润、侵袭等活动，参与结直肠癌的癌变、病情进展，且与结直肠癌患者预后密切相关[8-9]。癌胚抗原、糖类抗原19-9(CA19-9)等均是临床上筛查结直肠癌的常用血清标志物，但由于上述指标在多种癌症中亦有类似的变化，因此对患者预后预测特异性不高[10-12]。近年来，随着miR研究深入，发现其不仅存在于细胞和组织中，在体液中也能稳定表达，血清miR在肿瘤预后预测及辅助诊断等方面具有重要作用[13-15]。

有研究表明，miR-106b在胃癌中表达增加，且促进细胞侵袭[16]，发挥促癌功能，本研究也证实结直肠癌患者血清miR-106b-5p水平升高，且与肿瘤较大直径、淋巴结转移、远处转移及较晚临床分期密切关联，与以往研究证实的miR-106b-5p促进结直肠癌细胞增殖、侵袭的结论一致[17-19]，而其他相关研究团队则认

为miR-106b-5p表达降低，促进了结直肠癌细胞侵袭[20]，以上研究结论相悖，笔者分析miR-106b呈现多种不同效应，可能与不同研究体系有关，后续需要从分子生物学层面深入探究miR-106b-5p在结直肠癌细胞侵袭过程的具体调控机制，以支持本研究结论。

miR-30家族中的miR-30a包含miR-30a-3p和miR-30a-5p 2个亚型，分别来源于miR-30a前体茎环的3’端和5’端。目前对miR-30a-5p的研究，大多集中在肿瘤细胞增殖、侵袭方面，miR-30a-5p定位于人类6号染色体q13，除被证实可作为炎性因子外[21-23]，miR-30a-5p在不同类型肿瘤中表达趋势并不一致，如在Li等[24]的研究中，miR-30a-5p通过调控Erk/Ets信号通路活性，抑制乳腺癌增殖、侵袭，而Jia等[25]发现miR-30a-5p在胶质瘤中具有促癌基因功能，可能与不同肿瘤具有特异分子生物机制有关，说明miR-30a-5p参与调控肿瘤的复杂性。目前关于miR-30a-5p在结直肠癌中表达意义的研究有限，本研究发现，与结直肠腺瘤患者、健康体检者相比，结直肠癌患者血清miR-30a-5p表达降低，结合患者临床病理特征发现，血清miR-30a-5p低表达与肿瘤组织低分化、较深浸润深度、淋巴结转移及较晚临床分期关系紧密，上述结果表明miR-30a-5p低表达促进了结直肠癌癌变，并参与了肿瘤细胞去分化过程，如miR-30a-5p可通过作用于多种靶蛋白，对非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤EMT过程产生抑制作用[26]，而miR-30a-5p在结直肠癌中的分子调控机制，值得进一步探究。

图1 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平在结直肠癌患者不同预后中比较 图2 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平诊断结直肠癌价值的ROC曲线图

表3 血清miR-106b-5p、miR-30a-5p表达水平对结直肠癌诊断价值的ROC分析

对结直肠癌患者而言，肿瘤细胞浸润侵袭，进而发生淋巴结转移、远处转移是导致患者病情恶化、生存率低、预后差的重要因素。根据患者术后随访资料，绘制Kaplan-Meier生存曲线发现，血清miR-106b-5p高表达组、miR-30a-5p低表达组患者的预后均较差，术后5年生存率低且中位生存时间短，提示血清miR-106b-5p、miR-30a-5p可作为结直肠癌患者预后预测的分子标志物；ROC分析结果表明，血清miR-106b-5p、miR-30a-5p对结直肠癌均有较高的诊断价值，且二指标联合检测的敏感度、特异度明显升高。活检或术后的病理诊断是目前临床上结直肠癌的主要诊断手段，同时辅以血清肿瘤标志物检测，本研究结果表明，血清miR-106b-5p，miR-30a-5p检测可用于结直肠癌患者的辅助诊断，减少患者筛查结直肠癌的负担。但鉴于本研究为单中心回顾性研究，样本量小，存在一定局限性，研究结论有待进一步证实。

综上，结直肠癌患者血清miR-106b-5p呈现高表达、血清miR-30a-5p呈现低表达，且均与患者病情恶化进展、不良预后相关，检测血清miR-106b-5p、miR-30a-5p水平或可作为辅助结直肠癌的预后预测和诊断的有效手段。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张煌：提出研究方向、起草论文、撰写论文；鲁恒珍：数据收集和分析整理；周帅跃、郑华理：实施研究过程，进行文献调研与整理；朱爱萍：设计研究方案、研究思路、研究选题、修订论文、论文终审