应用PCR扩增方法对一起猪呼吸道混合感染的诊断

章国永，王晓杜

(苍南县动物疫病预防控制中心，浙江 温州 325800；2.浙江农林大学)

猪呼吸道疾病，临床以咳嗽、气喘、张口呼吸、生长缓慢为特征，病理剖检以肺部发生肉样或肝样病变，肺门淋巴结肿大为主，在全世界广泛流行。单纯感染猪肺炎支原体的猪只死亡率较低，但发病率高，且常常诱发其他病原微生物感染，引起临床症状加重、病死率增加，给养殖户造成严重的经济损失[1]。可以通过体外培养、多克隆抗体免疫荧光法[2-3]、PCR[4]等方法对猪肺炎支原体进行诊断。但是体外培养条件苛刻，现在常常用PCR的方法进行快速诊断。

1 发病情况

杭州某地方品种猪场，存栏300多头，该场管理不规范，没有进行正规的群体性免疫。在2014年7-8月份，笔者在该猪场实习，期间发现该场猪群出现与猪喘气病相似的临床症状。猪群呈群体性间歇性咳嗽，3-4月龄的育肥猪呈现张口喘气(时间持续在30 s左右)，间歇性的咳嗽，剧烈运动后更加明显，腹式呼吸，甚至犬坐式呼吸等呼吸道疾病症状。病猪精神萎靡、食欲不振、生长缓慢，渐行性消瘦。有些病猪体温升高至41～42℃，到病程后期，体温低下，呼吸极度困难，伴有泡沫状的口鼻分泌液，死亡后4～5 h有带血样的鼻液流出(见图1所示)。5月龄及以上的育肥猪，表现为运动气喘、拱背伸颈、咳嗽、毛发粗糙，未见猪只死亡。

图1 病猪临床症状

2 病理剖检结果

病理变化尸体剖检眼观病变主要在肺部。剖检病猪10头，可以发现9头肺叶有病变迹象，肺肿大、出血，呈暗红色、灰白色、浅红色，界限明显(如图2-1、图2-3所示)。硬度增加，外观呈“鲜肉样”、“虾肉样”病变(如图2-2、图2-4所示)。7头颌下淋巴结、肠系膜、腹股沟等处淋巴结肿大出血或坏死。其中有1头病死猪病程一周多，每天用抗生素治疗，死后发现该猪肠系膜粘连，胰脏、脾脏等器官萎缩坏死，皮肤出现紫色斑点。采集病死猪，病变明显的器官，肺脏、淋巴、小肠、脾脏等，用于后续实验室诊断。

图2 病死猪剖检结果

3 实验室诊断方法与结果

根据参考文献报导[5]，猪肺炎支原体(ATCC 25934)外显性p36(948 bp) 蛋白基因，构建检测猪肺炎支原体(948 bp)引物FSp36-RSp36，根据猪鼻支原体p37外显性蛋白基因，构建一对引物：Sp37-Asp37，用于检测猪鼻支原体(346 bp)。猪圆环病毒由浙江农林大学申老师实验室根据PCV2的ORF2基因设计的引物P20RF2F-P20RF2R，对病料进行PCR扩增鉴定后，送至上海生物工程有限公司合成，引物名称、核苷酸序列、目的基因大小如表1所示。

表1 PCR引物名称及其序列

3.1圆环病毒鉴别诊断 圆环病毒感染可引起猪群免疫损伤，是引起猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的病原体之一。而该养殖场猪群以呼吸道疾病为主，病死猪很可能因为猪群免疫损伤继发支原体感染，导致死亡率增加，故有必要对猪群进行PCV2的鉴别诊断。

用引物(P2ORF2F-P2ORF2R)检测猪圆环病毒(667 bp)。结果如图3所示。2-10号样电泳结果呈阳性，阳性率80%(95% CI=44.4%, 97.5%)，表明这8头猪均受到圆环病毒感染。

图3 圆环病毒-ORF2基因PCR扩增产物鉴定

3.2猪鼻支原体检测结果 猪鼻支原体，也可粘附到猪的呼吸道上皮细胞上，引起猪的肺炎，还可能引起浆膜炎、中耳炎等临床症状[6]，为了与猪肺炎支原体做出鉴别诊断，本研究用引物(Sp37-Asp37)检测10头病死猪肺部组织样本，结果如图4所示，仅9号样电泳结果呈阳性，阳性率10%(95% CI=0.3%, 44.5%)，表明10头猪中仅一头猪受到鼻支原体感染，说明该养殖场主要的病原不是猪鼻支原体。

图4 猪鼻炎支原体-p37基因PCR扩增产物鉴定

3.3猪肺炎支原体检测结果 用该对引物(FSp36-RSp36)检测10头病死猪肺部组织样本，结果如图5所示。3、4、6、7、8、9号样电泳结果呈阳性，其中3、6号样本呈弱阳性，阳性率60%(95% CI=26.2%, 87.8%)。表明这6头猪均受到猪肺炎支原体感染，初步说明该病的病原体为猪肺炎支原体。

图5 猪肺炎支原体-P36基因PCR扩增产物鉴定

4 讨论与结论

猪气喘病是地方性猪场的慢性呼吸道疾病，不同品种、性别、年龄的猪均可感染猪肺炎支原体，引起猪的气喘病。本研究对10头病死猪进行病理剖检，发现肺出血，呈暗红色、浅红色，“鲜肉样”、“虾肉样”病变。采集处理病死猪的肺脏，用PCR方法进行实验室诊断，结果显示：圆环病毒阳性率80%(CI 95%=44.4%-97.5%)，猪鼻支原体阳性率10%(CI 95%=0.3%-44.5%)，猪肺炎支原体阳性率60%(CI 95%=26.2%-87.8%)。说明该猪场很可能严重受到PCV2污染，引起猪免疫损伤，造成免疫力低下，继发支原体感染，增加死亡率。猪鼻支原体的阳性率远低于猪肺炎支原体，说明该猪场的气喘病很可能是由于猪肺炎支原体引起。

结合临床症状、病理剖检和PCR诊断三者的结果，表明该猪场确实受到圆环病毒和肺炎支原体混合感染。该养殖场猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗是不纳在常规疫苗之内的，建议猪场将这两种疫苗列入免疫计划之内，并加强饲养管理，建立科学养殖观念。