牛的胚胎移植技术

吴长玉，王廷斌，孙明林

（1.富锦市种畜场，黑龙江 富锦 156100；2.佳木斯市家畜繁育指导站，黑龙江 佳木斯 154007）

对于家畜的遗传改良，胚胎移植能从基因层面更好的展示母畜的优良血统。胚胎移植技术距今已有110 多年的研究发展历史。虽然人工授精技术已经广泛应用于家畜的遗传改良，但是胚胎移植也已证明是一种极为强大的技术手段，特别是用于优良血统母畜的基因扩繁。对于奶牛业，推广优良母牛采用超数排卵和胚胎移植（MOET），能促进良种繁育。

1 激素处理

对牛进行单个胚胎的收集，通常在对超排供体母牛进行激素处理后，再进行大量的胚胎移植。在牛，有两种超数排卵（超排）技术：一种是在发情期第10 天肌内注射PMSG 2 000～2 500 U，之后2～3 d 每隔12～24 h 注射2 次前列腺素PGF2α。发情牛需做直肠检查，以确认卵泡，若在发情后1.5 d以后排卵的不能用作受体牛。

使用PMSG的超排效果强于FSH，但使用FSH得到的胚胎质量却更高，所以商业上常使用FSH进行超排。商业应用的FSH 来自猪脑垂体提取物，混有LH。然而如果混有过多LH干扰FSH的最佳超排效果，但是少量的LH反而更有利于FSH的超排效果。

据报道称，一次性注射FSH可以获得满意的结果，但应连续肌内注射FSH 4～5 d，每日2次为最佳。商业用FSH用生理盐水稀释到20 mL，然后连续使用4～5 d。使用FSH 注射4 d 的方法是：第1 天4 mL·次-1，2 次·d-1；第2 天3 mL·次-1，2次·d-1；第3天2 mL·次-1，2次·d-1；第4天1 mL·次-1，2 次·d-1，总量为20 mL。出现发情后第10 天应用FSH。应用FSH后第3天或第4天注射PGF2α，12 h后重复1次。36～48 h后出现发情，发情开始后12及24 h观察体温变化，以进行人工授精，或在72、84、96 h 应用HCG 或GnRH 促进排卵。对奶牛可用的超排方法很多。比如超排前注射雌二醇或者阴道抽取优势卵泡。这些方法的目的是获得更多可用胚胎。

2 受体处理

观察到供体自然发情后，应同步对受体进行处理。供体牛和受体牛的比例一般为1：6～8。受体要选择体格大，膘情好，繁殖机能正常的适繁健康母牛。在移植前6～8周，对受体母牛逐头注射VA、VB、VD、VE 针剂，补充微量元素。在供体首次注射PGF2α12 h之前受体应注射PGF2α，受体会与供体同期排卵，但通过比较，供体与受体注射PGF2α相差±1 d比较好。超排率可以达到75%～90%，但20%～30%超排的母牛所产胚胎质量不好。使用FSH可以获得高质量的胚胎（每次能冲洗出0～20 个胚胎）。每次收集胚胎平均能获得5～7个高质量的胚胎，即可认为是满意的商业结果。

3 胚胎采集和处理

可在发情周期第7 天即胚胎定植子宫时进行胚胎采集。在采集胚胎之前，超排之后供体母牛触诊子宫可摸到黄体。从子宫液中采集胚胎方法如下：5～7 mL利多卡因硬膜外腔麻醉；使用肥皂或消毒剂洗净外阴，用量依据动物及其子宫颈大小，将安装有金属杆的导尿管插入阴道，用伸入直肠的触诊手臂将导尿管导入子宫颈；插入子宫颈后，将导尿管深入到一侧子宫角上1/3处；取出导尿管里的金属杆，管口充满15～20 mL 空气，空气量与子宫角大小有关，也与品种、年龄、胎次等有关；子宫颈中含有冲洗液，该液体富含抗生素及牛血清白蛋白，有些还有表面活性剂以减少胚胎形成泡沫；用冲洗液冲洗子宫角，每次25～50 mL，少量重复多次，将冲洗液导入胚胎滤器，可持续冲洗子宫角，或使用1～2 L冲洗液连续冲洗子宫；冲洗完成后，冲洗液会流入胚胎滤器中；胚胎滤器送到实验室后，应将其内容物放入检查盘中，可在10倍解剖显微镜下观察。将所有观察到的胚胎移入到另一个干净培养皿中，培养皿中有含有10%～20%胎牛血清或0.4%牛血清白蛋白的缓冲液。然后在40～60倍的高倍镜下观察胚胎，依据胚胎形态、发育程度（未受精卵母细胞、早期桑葚胚、紧密桑葚胚、胚泡、扩张胚泡、孵出胚泡等）、质量（优秀、良好、一般、差劣、变质）进行分类。质量判定依据胚胎的完整性、胚胎发育情况、细胞质颜色、细胞退化、卵裂球数量、卵周隙距离和胚胎大小等形态特征进行评估。

只有中等、良好或优秀的胚胎可以移植；至少清洗胚胎3遍之后将其保存在培养液中。将移植的胚胎移入干净的含有培养液的器皿中，目的是剔除细胞碎片及可能黏附在透朋带上的病原体。在室温下保存胚胎，直到移植入受体中或冷冻或进行性别判断。

4 胚胎植入

胚胎移植时可用0.25 mL细管分3段吸入PBS保存液，中间由2个气泡隔开，中断含有胚胎。胚胎移植枪放在无菌的套子里，以避免移植枪头部对动物会阴部和阴道造成污染。借助于直肠检查，将移植枪送入子宫颈，然后再插入同侧带有黄体的子宫角。细管里的胚胎等内容物要尽量置于细管顶端，以避免延长不必要的手术时间。第1次接受胚胎移植后，60%～70%的受体可以妊娠，移入2 个胚胎的受孕率可高达90%。大量的牛移植胚胎都是经过良好处理的冻融胚胎（46%），一般的受孕率＞50%。在同样的条件和熟练的操作技术下，冻融胚胎理论上比新鲜移植的胚胎受孕率低10%。孕酮具有保胎作用，注射孕酮，可提高受胎率。早期确诊的方法有放射免疫测定和酶联免疫测定。虽然移入的胚胎量越多动物的妊娠率越高，但是由双胎引起的难产和胎衣不下的危险率也会增高，而且由此而导致的异性孪生不孕的可能性增高，从而限制了这种方法的广泛应用。