促甲状腺激素受体蛋白A亚基的结构特点、重组表达及应用研究进展

刘玉盒，陈慧

1兰州大学第二医院，兰州 730030；2甘肃省泌尿系统疾病重点实验室

Graves病(GD)是常见的自身免疫性甲状腺疾病，世界范围内患病率女性约为3%、男性约为0.5%[1]。促甲状腺激素受体(TSHR)是GD特异性抗原，GD是靶向TSHR抗原导致甲状腺功能亢进的自身免疫性甲状腺疾病，是环境因素相关的遗传易感人群对TSHR抗原的耐受性丧失[2]。TSHR位于甲状腺上皮细胞表面，为G蛋白偶联受体家族成员之一，生理条件下TSH与其受体TSHR结合，经G蛋白激活产生级联反应以实现生物学效应。而GD病理情况下，TSHR激发机体产生TSHR自身抗体(TRAb)，TRAb分为刺激性抗体(TSAb)和抑制性抗体(TBAb)，TSAb的生物效应类似(TSH)，可与TSH竞争性结合在TSHR上，通过产生cAMP，刺激甲状腺滤泡细胞分泌合成甲状腺素，继而可引起GD，激活TSHR的促甲状腺抗体(TSAb)是GD甲状腺功能亢进症的直接原因。TBAb由于可以阻断TSHR的信号传递，部分甲状腺功能减退症和甲状腺萎缩是由TSH阻断抗体(TBAb)引起的[3]。母体的TSHR自身抗体会通过胎盘转移在新生儿中引起短暂的GD[4]，注射单克隆刺激性TSHR抗体足以诱发小鼠甲状腺功能亢进[5]。因此探讨TSHR及其亚基的结构、A亚基的脱落机制以及TSHR致机体产生自身抗体产生的原理及其两者之间的相互作用是研究GD发病、复发和转归的关键，同时为改进诊断和治疗GD病寻找新潜能。现就TSHR A亚基的结构特点、重组表达及应用研究进展情况作一综述。

1 TSHR A亚基的结构特点

TSHR由764个氨基酸组成，相对分子质量约为85 kD，由膜外区、跨膜区和膜内区三部分组成，是一种七次跨膜糖蛋白受体，属于G蛋白偶联受体家族(GPCRs)的一员。膜外区有418个氨基酸，呈亲水性，包含一个富含亮氨酸的重复结构域，该结构域通过一个铰链区与跨膜结构域相连，在翻译后加工过程中，TSHR的膜外区可在两个或者多个位点裂解而形成两个亚基，即A亚基和B亚基。TSHR1-22残基为信号肽，残基22-289包括整个TSHR富含亮氨酸的区域(LDR)和铰链区域的近端部分[称为信号特异性区域(SSD)]，LRD和SSD一起构成了A亚基，A亚基缺少TSHR胞外结构域的C端(氨基酸290-418)以及3个胞外环。位于第317～366位的氨基酸，可能是TSHR羧基端与氨基端相连接的部位，可称之为连接肽或者C肽，A亚基通过C肽与B亚基通过半胱氨酸残基构成的二硫键结合在一起。与其他的促性腺激素受体不同，TSHR可被分割成亚基，断裂二硫键会导致TSHR A亚基的脱落[6]，这些促性腺激素受体不会在人体中诱导自身免疫反应。并且强有力的证据表明脱落的TSHR A亚基，并非TSHR整体受体促进机体B细胞产生自身抗体，从而诱发甲状腺功能亢进[7]。研究者将125I-TSH与甲状腺、FRTL-5大鼠甲状腺细胞相互作用，发现TSHR是一个相对分子质量为80 kD的异二聚体，包含两个大小不同的亚基，一分子量大约为45 kD，存在于甲状腺细胞膜外，亲水性，是125I-TSH结合的位点，称为A亚基，另一个分子量大小约25 kD，通过二硫键连接在A亚基上，称为B亚基[8]。TSHR A亚基蛋白分子量较小，而且在甲状腺中的含量非常低。TSHR是由单个mRNA编码的，因此TSHR亚基是由单个多肽链分子内裂解形成的，在TSHR蛋白合成后期，即在高尔基复合体上或在甲状腺细胞表面，TSHR被切割成A和B亚基[9]。用TSHR特异性单克隆抗体观察到人胸腺细胞TSHR的A亚基比B亚基少3倍[10]，重组表达人TSHR的小鼠骨髓瘤细胞核中国仓鼠卵细胞(CHO)均观察到A亚基数量少于B亚基[11]，因此认为甲状腺细胞表面，铰链区的二硫键断裂导致A亚基脱落，成为GD的自身抗原，产生促甲状腺素受体抗体(TRAb)[12]。在非生理条件，如甲状腺组织匀浆反复冻融或甲状腺细胞培养液胎牛血清浓度降低的情况下，TAHR的A亚基脱落明显，可能A亚基脱落与细胞活力下降或蛋白自噬相关。进一步研究发现，二硫异构酶(PDI)和硫氧还蛋白是已知细胞表面减少二硫键形成的酶，使用PDI特异性单克隆抗体抑制PDI酶活性，TSHR的A亚基脱落明显减少。二硫异构酶可能参与A亚基的脱落[13]。

2 TSHR A亚基的重组表达

甲状腺组织中TSHR分子量极少，大约每个甲状腺细胞少于5 000个，并且TSHR蛋白的高度构象性或外显子区的糖基聚糖含量极高使其纯化受到了极大阻碍，然而为进一步探讨TSHR的结构与功能的关系、GD的发病机制及可能的免疫治疗，都需要高水平的纯化蛋白[14]。决定是表达整体受体还是外显子在很大程度上取决于重组TSHR的预期用途，TSHR全长具有跨膜片段是研究TSHR信号转导的必要条件，如果研究TSH或TRAb与TSHR蛋白的结合机制、或产生TSHR特异性单克隆抗体等，外显子或外显子结构的一部分更有利。近20年来，人们一直努力在各种系统中表达TSHR及其片段蛋白，原核细菌、昆虫细胞克隆表达的重组蛋白及合成肽均无法与TSH和TRAb结合。哺乳动物细胞是生成构象完整的TSHR最有效的方法，重组蛋白具有TSHR生理功能，稳定表达TSHR的细胞在TSH和TSHR自身抗体刺激后传递信号，然而虽然这种表达水平远高于甲状腺组织，但表达量仍然太低，每个细胞有2 000～5 000个受体，仍不能纯化TSHR[15]。在哺乳动物细胞中，TSHR胞外结构域以含有未成熟的高甘露糖碳水化合物的形式保留在细胞内，通过对TSHR外显子结构域羧基端逐步截短可以克服这一困难，如截短为外域体TSHR-261、TSHR-289、TSHR-309，不同外域体分泌于培养基的量与其大小成反比，且其能有效的与GD患者血清结合[16]。3BD10为转染CHO细胞表达的TSHR A亚基(TSHR-289)获得的单克隆抗体(MAb)，CHO细胞表达的TSHR A亚基只有部分能被3BD10识别，此部分不能被GD患者血清TRAb识别，而能被GD患者血清TRAb识别的部分，无法被3BD10识别，遂将能被GD患者血清TRAb识别的TSHR A亚基结构形式称为活性形式，能被3BD10识别的称为非活性形式。活性TSHR-289完全中和了所有血清中TSAb的活性，相同数量的非活动TSHR-289对TSAb活性无中和作用[17]。重组TSHR A蛋白的这种活性，可以用3BD10柱将两者依次分离纯化，活性和非活性TSHR A亚基考马斯染色具有相同的摩尔大小，相同的多肽骨架，糖基化程度都较高，37 ℃加热1 h重组TSHR A亚基从活性形式转化为非活性形式，然而在纯化的活性形式TSHR-A亚基中加入一种化学伴侣三甲胺N-氧化物，可防止其转变为非活性形式，即使加热到37 ℃持续30 h也，仅在折叠上存在差异。2015年，Chen等[18]通过晶体x衍射解析出3BD 10和TSAb都能与真核细胞表达的TSHR A亚亚基单体结合，活性和非活性A-亚基均是多聚体，分别是三聚体和二聚体。

3 TSHR A亚基的应用

3.1 用于GD动物模型的构建 如果不进行主动免疫接种，仅仅有实验室培育的大鼠，非肥胖糖尿病(NOD)和NOD.H2h4小鼠以及某些犬类、部分猴可自发发生自身免疫性甲状腺炎，但与TSHR抗体和GD的甲状腺功能亢进症均不会在动物中自发发生，GD仅影响人类。与自身免疫性甲状腺炎不同，通过注射甲状腺提取物等常规方法不能诱导动物产生TSAb，并导致甲状腺功能亢进症的。成功诱发GD或其标志物的标准是存在生物活性抗体(TSAb)和(或)甲状腺功能亢进症。用TSHR蛋白进行常规免疫接种既不会诱导TSAb也不会诱导甲状腺功能亢[19]。用重组TSHR蛋白与多种佐剂一起注入许多不同的小鼠品系，可在ELISA中诱导结合TSHR蛋白的抗体，但是，这些抗体缺乏刺激从表达TSHR的细胞释放cAMP的能力(即没有生物活性，小鼠仍处于甲状腺功能正常状态，可能小鼠TSHR的耐受性不会被人TSHR免疫所破坏。通过给小鼠注射表达TSHR的完整细胞，可以诱导出刺激TSAb[20]。用人TSHR A亚基免疫的小鼠的T细胞不会与小鼠TSHR肽段交叉反应，一种很少使用的方法是用表达TSHR的B细胞和TSHR蛋白质和佐剂免疫小鼠[21]。通过使用质粒或腺病毒载体在小鼠体内表达TSHR体或其A亚基可有效诱导TSAb和(或)甲状腺功能亢进，经过20年探索，目前使用最广泛的是Ad-TSHR-289诱导的GD模型，该模型用A亚单位的重组腺病毒免疫雌性BALB/c小鼠所形成，其特点主要有甲状腺肿大、血清促甲状腺激素受体抗体(TRAb)以及总甲状腺素(TT4)水平增高、甲状腺组织病理符合甲亢表现等[22]。与不会分裂为两个亚基的TSHR免疫相比，用A亚基免疫小鼠可更有效地诱导甲亢，Chen等分别采用人腺病毒-TSHR-A亚基、腺病毒-TSHR全长免疫BALB/c雌鼠，结果显示Ad-TSHR-289组80%小鼠T4水平增高，而Ad-TSHR全长组仅为10%，A亚单位组的TSAb活性明显高于全长组，说明TSHR-A亚单位具有更强的免疫原性，相比TSHR全长能更有效的诱导小鼠GD[23]。采用腺病毒-TSHR A亚基电穿孔(EP)技术进行基因免疫，有效地诱导出小鼠甲亢，并且TSAb抗体超过8月仍持续存在[24]。甚至运用腺病毒TSHR A亚基肌肉电穿孔成功构建GD眼病模型，出现了眼眶肌肉肥大、视神经周围大量浸润、广泛脂肪形成，球后脂肪组织扩张、新生及扩张的眼眶血管等眼眶病变[25]。此外研究认为，CD40是与自身免疫性甲状腺疾病相关的基因之一，甲状腺中CD40的过表达会增加人A亚单位腺病毒免疫诱导鼠GD的严重性[26]。

3.2 用于GD自身抗原免疫特异性的治疗 近一个世纪以来，GD的治疗都未有大的改进和突破，新兴起的非特异性免疫治疗方法包括TSHR功能的小分子抑制剂，阻断TSAb功能的抗体，以及针对B淋巴细胞适应性免疫系统的抑制剂(如利妥昔单)，亦都只是可以治疗但不能治愈GD，并且非特异性免疫抑制剂有潜在的严重副作用[27]。在表达TSHR A亚基的腺病毒诱导GD模型中，用TSHR合成肽预处理，发现小鼠对腺病毒-TSHR A亚基的体液免疫和细胞免疫应答都减弱[28]。在未激活先天免疫系统的情况下预先施用TSHR A亚基蛋白会诱导耐受性，从而通过随后的A亚基腺病毒免疫减弱甲亢的诱导。遂运用真核细胞CHO克隆表达的TSHR A亚基预处理，发现其可抑制甲状腺功能亢进症状，但仍无法彻底治愈甲亢，蛋白预处理并没有诱导耐受，而是将抗体反应从TSAb转移到TBAb上;相反，甲亢诱导后再注射TSHR A亚基蛋白无效[29]。注射TSHR A亚基可以使TSAb向非功能性刺激抗体的转变是否可以治疗GD？然而注射TSHR A亚基蛋白抗原可能激活TSHR特异性T细胞，因此考虑将A亚基蛋白疫苗接种方法用于人类之前，必须确保注射它不会激活TSHR特异性T细胞并促进或加剧GD眼病。研究者将新生儿耐受性的作用原理应用于小鼠GD的TSHR-腺病毒模型，出生后24 h内向小鼠注射大剂量的TSHR-Ad可建立耐受性，并防止随后诱发TSAb和GD甲状腺功能亢进，但低剂量TSHR-Ad无效[30]。NOD.H-2h4小鼠(NOD小鼠与B10.A(4R)杂交小鼠)可自发地发生自身免疫性甲状腺炎，并且有较高的发病率，能自发地产生TPO、TG抗体，但不会产生TSHR抗体[31]。将人TSHR A亚基导入NOD.H2h4小鼠甲状腺，可自发产生TSHR抗体，建立自发GD模型，然而其TSAb对NOD.H2h4小鼠TSHR有较小的抑制作用，血清中虽存在有活性TSAb，但无甲状腺功能亢进症状[32]。将人TSHR A亚基转移到NOD.H-2h4小鼠导致对该蛋白的耐受性丧失，注射TSHR A亚单位蛋白通过将致病的TSHR抗体转化为非功能性TRAb来减轻甲亢，然而给TSHR/NOD.H-2h4小鼠注射非活性形式的重组TSHR-A亚基(不添加佐剂)，ELISA检测发现TSAb水平提高了[33]。使用纳米粒子(NPs)来传递耐受性分子，使机体产生耐受性树突状细胞和T细胞的呈递，运用纳米粒子抗原传递方法，NOD小鼠未发生Ⅰ型糖尿病。使用重组TSHR A亚基蛋白联合同样的纳米粒子(NPs)传递的耐受性分子免疫TSHR/NOD.H-2h4小鼠，可能为一种有效的GD的治疗方法。诱导自我耐受以预防自身免疫性甲状腺疾病的目标将需要对有风险的个体进行准确的预测，并采用抗原特异性的治疗方法。

总之，TSHR A亚基在促甲状腺素抗体(TRAb)的产生、TRAb与TSHR相互作用和刺激、阻断TSHR的分子机制，检测患者血清中TRAb以及GD的进一步诊治、甚至预防等方面均有重大的意义。TSHR A亚基蛋白联合纳米分子可能成为一种有效的治疗GD新方法，对于人体自身免疫性疾病也可能成为重大突破，但大量高纯度有活性TSHR A亚基蛋白的获得仍是关键。