Cullin7 泛素连接酶在生长控制和肿瘤发生发展的作用

牟宇，陈治军，谢腾，向旭

(湖北民族大学荆门临床医学院，湖北 荆门)

1 CRL7Fbxw8 复合体的结构和功能

CRL7Fbxw8 复合物是cullining E3 泛素连接酶(CRL)家族的成员[1]。CRL7Fbxw8 包括cullin 7，WD40 重复序列，包含F-box 蛋白Fbxw8，适配器蛋白Skp1，以及环finger 蛋白ROC1[2]。

CRL7Fbxw8 具有两个独特的生化特性。首先，CUL7 是一种非典型的cullin 家族蛋白。CUL7 的主要功能是提供组织E3 CRL 复合物的分子支架。然而，人类CUL7 包含1698个氨基酸，其大小是规范的cullin 分子的两倍多。如下所述，CUL7 似乎包含多个蛋白质-蛋白质相互作用域，从而为蛋白水解和非蛋白水解活性提供了一系列生化功能。其次，虽然CUL7 组装了SCF/CRL1 类复合物，但它主要通过与Skp1-Fbxw8 相互作用而显示出显著的选择性。自从对CRL7Fbxw8复合物的首次报道以来[2]，许多独立的报告证实了CUL7-Fbxw8 的关联[3-8]。但是当前没有高分辨率CUL7-Fbxw8 相互作用的结构模型，以帮助理解选择性的分子基础。

3-M 是一种人类常染色体隐性生长迟缓综合征[9]。2005年，首次将cul7 生殖系突变与3-M 综合征联系起来[10]。自那时起，就证实并扩展了这种联系[11-12]。迄今为止，已有64个3-M 连锁的cul7 突变被报道。这些突变跨越了整个CUL7编码序列。许多突变可能通过mRNA 衰变或显著的蛋白质截短机制而使CUL7 活性丧失。然而，还是存在可以帮助CUL7结构活性关系分析的取代突变。例如，源自3-M 的错义突变H1464P 驻留在CUL7cullin 结构域中，并且被证明引起E3 连接酶活性的降低[10]。此外，CUL7 突变可能与3-M 矮小综合征有关。

随后的研究发现，obscurin-like 1(OBSL1)[13]和包含8 的卷曲螺旋结构域(CCDC8)[14]的突变也会导致3-M 综合征。CUL7 似乎是导致3-M 综合征的主要基因。3-M 突变的发生率在CUL7 中约为70%。在OBSL1 中为20%，而在CCDC8中为10%以下[15]。

CUL7，OBSL1 和CCDC8 似乎也相关联。证据表明，CUL7，OBSL1 和CCDC8 在指定为3-M 的复合体中，其中还包括Fbxw8[8]。OBSL1 是一种细胞骨架衔接蛋白，将细胞的内部细胞骨架连接到细胞膜。CCDC8 包含多个蛋白质-蛋白质相互作用域，能够与OBSL1、CRL7Fbxw8 相互作用，以及通过其C 末端定位的PxLPxL 基序相互作用的其他蛋白质[16]。

在最近的一项研究中表明CCDC8 仅位于质膜上。CK2和GSK3 将CCDC8 磷酸化，使其与OBSL1 和CUL7 结合，从而导致膜相关的3-M 复合物组装。这些作者进一步确定了质膜蛋白LL5β 是3-M 复合物的底物[17]。Wnt 信号转导抑制CCDC8 磷酸化会破坏3-M 复合物的膜定位和LL5β 的积累。在表达带有3 个衍生突变的CUL7 或OBSL1 的细胞中也观察到了此类缺陷。小鼠中Ccdc8 的缺失导致滋养细胞迁移和胎盘发育缺陷，并表现出子宫内生长受限和围产期致死性。

2 CRL7Fbxw8 在生长控制中的作用

cul7 突变与人类遗传综合征3-M 和雅库特综合征的关联，证明了CRL7Fbxw8 在生长控制中的作用[10]。与人类遗传学证据一致，小鼠cul7 基因的定向破坏导致严重的子宫内发育迟缓(IUGR)，在妊娠后期和胎盘异常时胎儿明显较小[2]。CUL7 基因在IUGR 中被上调多达10 倍，在与IUGR 相关的子痫前期中被上调15 倍[18]。生长激素信号转导的失调似乎是3-M 综合征的特征。例如，携带cul7 或ccdc8 突变的3-M患者的成纤维细胞分别显示IGF1 或生长激素信号转导受损。包含obsl1 突变的3-M 成纤维细胞在两种途径中均表现出损伤[15]。

fbxw8 基因的破坏导致表型较轻，异常主要局限于胎盘和生长[19]。大约30%的纯合子fbxw8-/-后代成年，即使在整个产后发育期间它们的体型都小于野生型同窝仔。因此，CUL7 和Fbxw8 在生长控制中具有重叠的功能，这与CUL7 使用Fbxw8 介导增殖活性的假设相一致。另一方面，cul7 -/-小鼠的更严重的表型暗示Fbxw8 独立功能。

有人提出了一些蛋白质水解机制解释CRL7Fbxw8 在生长中的作用，控制总结如下。

IRS1 和mTORC1 负反馈回路：胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)通过与受体结合来刺激生长。配体结合受体酪氨酸激酶然后在多个酪氨酸残基处磷酸化胰岛素受体底物(IRS1)。由此产生的磷酸酪氨酸提供了能够招募含有SH2(Src 同源2)的信号蛋白的对接位点，这些信号蛋白包括PI3-K(磷酸肌醇3-激酶)和Grb2(生长因子受体结合蛋白2)，从而分别激活下游Akt(蛋白激酶B；通过PI3-K)和RAS(通过Grb2)途径。活化的Akt 抑制TSC1/2(结节性硬化1/2)复合物，从而释放小G 蛋白Rheb(Ras 同系物enrichedinbrain)。mTORC1(雷帕霉素复合物1 的蛋白激酶机制靶点)[20-21]和下游效应酶6K1(s6kinase1)，导致核糖体生物生成和细胞生长[22-23]。高活性mTORC1/S6K1 催化多位点IRS1 seryl 磷酸化，抑制IRS1与胰岛素/IGF-1 受体相互作用的能力，并促进蛋白酶体降解[24]。这种mTORC1/IRS1 负反馈减弱PI3-K 活性的强度或持续时间，以确保最佳的mTORC1 信号[23]。

几项证据表明CRL7Fbxw8 在mTORC1/IRS1 负反馈控制中的作用是通过靶向IRS1 实现泛素非依赖性降解。Fbxw8与IRS1 结合并促进其泛素化和蛋白酶体降解；Fbxw8 和CUL7 的失活/ 缺失分别累积IRS1。重要的是，fbxw8 诱导的IRS1 降解依赖于mTORC1 活性[25]。为了支持这些观察，发现cul7 -/-小鼠的胚胎成纤维细胞积累了IRS1，并表现出IRS1 下游途径Akt 和MEK/ERK 的激活增加。有学者提出，过度激活的mTORC1/S6K1 引发IRS1 的多位丝氨酸磷酸化，触发IRS1 与CRL7Fbxw8 的结合，导致IRS1 泛素化和降解，进而导致PI3-K/Akt 活性减弱。

大量的生化[26]和生理学[27]证据证实，IRS1 降解信号序列被映射到其N 端574 个氨基酸残基上。在该片段中，Ser-307/Ser-312 和Ser-527 构成S6K1 磷酸化共有位点，这些位点被认为是支持Crl7FBxW8 介导降解所必需的[26]。利用体外重建系统，用S6K1 刺激CRL7Fbxw8 对IRS1 N 末端片段的泛素化作用，但作用水平较低。相反，CRL7Fbxw8 支持从感染昆虫细胞中分离的高磷酸化IRS1 N 末端片段的高效泛素化。这些数据表明激酶需要额外的磷酸化还没有确定。有人提出，IRS1 的N 末端需要多磷酸化才能确保只有当mTORC1和S6K1 达到极高水平时，IRS1 才会完全降解。此外，在cul7小鼠胚胎成纤维细胞中观察到胰岛素刺激增强的AKT 和MAP 激酶磷酸化[27]。与此一致，C2C12 肌管中的RNA 干扰导致CUL7 基因敲除，从而导致胰岛素消化途径和细胞葡萄糖摄取水平升高。CUL7 的缺失降低了这些细胞介导胰岛素诱导的irs1 降解的能力。在小鼠模型中，与野生型对照组相比，杂合子CUL7 或fbxw8 在胰岛素刺激下提高了骨骼肌组织中PI3-K/AKT 的激活。最后，在cul7 + /或fbxw8 + /小鼠中观察到增强了胰岛素敏感性和血浆葡萄糖清除率另一项研究表明，通过直接磷酸化Fbxw8，IRS1 的mTORC2 依赖性反馈抑制作用，导致该F-box 蛋白的稳定性增强，从而促进IRS1降解[28]。总之，这些研究表明CRL7Fbxw8 在影响mTORC1和mTORC2 信号传导中起着重要作用。然而，有些研究与上述观点不一致，他们认为尽管未检查IRS1 的磷酸化状态，但未能观察到CRS7 耗尽的细胞中IRS1 的积累[29]。最近，已确定人类IRS1 S422 是mTORC1 磷酸化的关键残基，其似乎触发了与SCF/CRL1βTrCP 的相互作用以进行降解[30]。然而，需要进一步的工作来为βTrCP 与IRS1 S422 degron 肽的直接结合提供证据，这与充分定义的βTrCP 底物结合共有基序显著不同。

TBC1D3 和生长因子信号转导：人源特异性TBC1D3 肿瘤蛋白增强生长因子受体信号传导，随后促进细胞增殖和存活。TBC1D3 响应于生长因子信号而降解，从而构成生长因子驱动的负反馈回路[5]。多种证据表明，CRL7Fbxw8 靶向TBC1D3，在血清和生长因子刺激下泛素化和降解。

Hippo 信号转导与心肌细胞增殖：利用心肌细胞模型，发现心肌细胞增殖抑制，可能与Hippo 激酶Mst1 和Lats1/2 的积累有关，提示Hippo-YAP 信号转导在心脏发育中的作用。CUL7 参与控制Mst1 的丰度，因此参与Hippo-Yap 信号传导和心肌细胞增殖[31]。

3 CRL7Fbxw8 在癌症中的作用

P53: 已有研究报告了映射到CUL7 CPH 域和p53 的四聚化域的CUL7-p53 相互作用[32]。根据现有证据显示，CUL7-p53 相互作用的结果似乎拮抗p53 的肿瘤抑制活性。细胞培养研究表明，CUL7 表达导致p53 转录活性降低[32]。细胞增殖速率的增加需要完整的p53[32]和抑制p53 对DNA损伤的激活[33]。其他证据包括CUL7 在抑制Myc 诱导的凋亡中的作用，尽管这种作用是否依赖于CUL7-p53 的相互作用还没有被阐明[34]。到目前为止，还没有证据表明crl7fbxw8通过泛素调节p53 而导致p53 稳定性的改变[33]。

SV40 T 抗原及其转化：CUL7 最初通过免疫沉淀研究证明为宿主细胞蛋白p185[35]或p193[36]，其在1990 年代初与猿猴病毒40 大T 抗原相关，很久以后才被识别为成分E3 泛素连接酶复合物的合成[2]。现有研究已将CUL7 结合位点定位于T 抗原69-83 位氨基酸[37]。与CUL7 结合缺陷的T 抗原突变体，虽然仍能与p53 和pRb 相互作用，但不能诱导小鼠胚胎成纤维细胞增殖。这些数据表明T 抗原的转化能力不仅需要p53 和pRB，还需要CUL7 活性的失活。这些结果证明了CUL7 作为肿瘤抑制因子的作用，至少需要存在有效的肿瘤蛋白T 抗原的情况下。

为了验证上述观点，已有研究表明，野生型T 抗原，抑制了26S 蛋白酶体对CRL7Fbxw8 底物IRS1 的降解。在表达T抗原的细胞中观察到IRS1 的积累和延长的半衰期。与此一致，纯化的T 抗原抑制了CRL7Fbxw8 依赖的IRS1 泛素化[38]。此外，表达T 抗原的细胞，或通过RNA 干扰耗尽CUL7，显示IRS1 下游信号通路PI3-K/AKT 和Erk 丝裂原激活通路激酶的激活增强，以及下游靶基因c-fos 的上调。最后，在T 抗原阳性的癌胚抗原424/SV40 LT 转基因小鼠中检测到IRS1 蛋白水平的升高和下游信号的激活。总之，这些结果提示T 抗原在保护IRS1 不被crl7fbxw8 降解中的作用。这种病毒活性可能在维持高水平的有丝分裂前IRS1 下游信号通路中发挥作用。

总体而言，这些研究可以调和CUL7 癌基因/肿瘤抑制因子悖论[39]。在正常细胞中，mTORC1/IRS1 反馈功能可确保正确的mTOR 信号传递[23]。CUL7 的缺失导致持续的mTOR 信号传导，导致衰老[25]。这与CRL7Fbxw8 生长控制的作用保持一致。但是潜在的肿瘤蛋白T 抗原控制着细胞的高水平增殖。通过T 抗原介导的IRS1 降解抑制，打破mTORC1/IRS1 负反馈环，可能是维持有丝分裂前信号传导，从而满足增殖需要的必要条件。

细胞周期蛋白D1 与细胞周期：细胞周期进入S 期需要通过重新定位和降解去除cyclind1。持续的MAPK 信号传导(肿瘤细胞特有的特征)导致细胞周期蛋白D1 在T286 磷酸化，从而触发与CRL7Fbxw8 的相互作用，导致泛素依赖性蛋白酶体降解[7]。Fbxw8 基因敲除导致细胞周期蛋白D1 的大量积累，以及CDK1 的胞质隔离，导致细胞增殖的严重减少。细胞周期蛋白D1-T286A 的组成性核表达逆转了这些效应。这些发现支持CRL7Fbxw8 通过细胞周期蛋白D1 的蛋白水解在癌细胞增殖中的作用。然而，来自fbxw8 小鼠或野生型的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)显示出相似的细胞周期蛋白D1 降解率。这些遗传分析对Fbxw8 在正常细胞周期进程中细胞周期蛋白D1 降解中的重要作用提出了疑问[40]。

HPK1、MAPK 与胰腺癌：造血祖细胞激酶1(HPK1) 抑制MEK1/2 介导的ERK 活化，并通过蛋白酶体介导的降解在＞95%的胰腺癌中丢失。HPK1 可能是一种新型的肿瘤抑制因子，而HPK1 的缺失在胰腺癌的发展中起着至关重要的作用。敲除Fbxw8 可恢复内源性HPK1 蛋白表达并抑制胰腺癌细胞的细胞增殖。这些发现表明CRL7Fbxw8 在构成负反馈环以抑制HPK1 的生长抑制活性中起作用，并且CRL7Fbxw8促进胰腺癌细胞增殖。

4 结束语

自2002 年发现以来，CRL7Fbxw8 已被证实参与了十多种蛋白质底物的稳定性控制。另外发现了两种3-M-连接蛋白OBSL1 和ccdc8 及其与CRL7Fbxw8 的联系，突出了E3 复合物在其生物学功能和生长迟缓疾病中的重要亚细胞位置。

目前尚不清楚在小鼠cul7 基因敲除和/或带有cul7 突变的人类3-M 综合征中观察到的生物学缺陷是否可归因于发现的任何CRL7Fbxw8 底物的异常积累。迄今为止，可能我们还没有鉴定出了CRL7Fbxw8 的某种底物，该底物起着主要的生长调节作用，并且在失调时会导致3-M 生长迟缓。或者，3-M 可能是由受CRL7Fbxw8 影响的多种蛋白水解途径失调引起的疾病。还应注意，CUL7 具有非蛋白水解功能，可能在细胞增殖和3-M 综合征中起重要作用。

我们认为，继续使用遗传和生化方法将有助于更好地了解CRL7FBXW8 的生长控制和肿瘤中的作用，先进的小鼠模型可以用来模拟人类3-M 综合征，更精确地阐明CRL7Fbxw8在细胞增殖信号通路中的作用。深入研究CRL7Fbxw8 的蛋白质和非蛋白质水解功能可能产生新的机制。希望这些发现能为3M 及相关生长迟缓综合征的治疗开辟新的治疗途径。