中药注射剂超敏反应评价和风险控制相关问题的思考

梁爱华，易艳

（中国中医科学院中药研究所 中药鉴定与安全性检测评估北京市重点实验室，北京 100700）

2006年鱼腥草注射液严重超敏反应事件使得中药注射剂（traditional Chinese medicine injections，TCMI）的安全性问题成为社会关注的焦点。2009年7月，原国家食品药品监督管理局发布了《关于做好中药注射剂安全性再评价工作的通知》[1]，开始推进全面提高TCMI的质量可控性、安全性、有效性，控制TCMI风险的工作。2010年原国家食品药品监督管理局发布了《关于印发中药注射剂安全性再评价生产工艺评价等7个技术指导原则的通知》[2]，以指导TCMI安全性再评价工作的开展。文件发布后，少数TCMI生产企业开始着手开展其产品的临床不良反应（ADR）集中主动监测、药学研究以及临床前安全评价研究等工作，对部分产品的质量和安全性提升起到了积极作用。然而，由于TCMI安全性问题的复杂性，以及再评价缺乏可参考的经验和具体工作细则等原因，再评价工作并没有顺利落实。2018年原国家食品药品监督管理总局发布了《2017年度药品审评报告》，报告中提到“将研究启动中药注射剂再评价工作，并制定再评价技术指导原则”，体现了国家对降低TCMI致ADR的决心和要求。笔者课题组近年来围绕TCMI超敏反应特点、临床前安全性评价新方法以及产品风险控制等相关问题开展了一些研究，本文对该研究进展进行简要介绍，旨在为拟开展TCMI安全性再评价的机构和企业提供参考。

1 中药注射剂的临床应用

我国现有130余个TCMI品种，其中临床常用品种只有40 ～ 50个，以功能主治分类排在前4位的是清热剂、理血剂、祛湿剂、补益剂，在病毒感染性疾病、心脑血管疾病、肝脏疾病、肿瘤等治疗中应用较广泛。TCMI被纳入我国相关的感染性疾病或心血管疾病诊疗指南/诊疗方案，用于相关疾病的治疗，尤其是在一些传染性疾病治疗中发挥了积极作用。2003年，中华中医药学会发布的《传染性非典型肺炎（SARS）中医诊疗指南》[3]中推荐清热解毒类注射剂清开灵注射液、双黄连粉针剂、复方苦参注射液等治疗SARS早期或进展期的疫毒犯肺、疫毒壅肺以及肺闭喘憋证等；推荐活血化瘀、祛湿化痰类注射剂香丹注射液、丹参注射液、灯盏细辛注射液、川芎嗪注射液等用于进展期和重症SARS肺闭喘憋证；推荐扶正类注射液参麦注射液、参附注射液、生脉注射液、黄芪注射液用于SARS各期正气亏虚者。中华人民共和国卫生部在《手足口病诊疗指南》（2013版）[4]中推荐喜炎平注射液、热毒宁注射液、丹参注射液用于手足口病普通型湿热郁蒸证；参附注射液、痰热清注射液、喜炎平注射液用于重型病例毒热动风证。国家卫生计生委员会在《登革热诊疗指南》(2014年版)[5]中推荐热毒宁注射液、痰热清注射液、清开灵注射液、血必净注射液用于急性发热期湿热郁遏证以及极期毒瘀交结、扰营动血者；参麦注射液、生脉注射液、参附注射液用于极期暑湿伤阳，气不摄血者。国家卫生计生委员会组织制定的《人感染H7N9禽流感诊疗方案》2014年版[6]和2017年版[7]推荐喜炎平注射液、热毒宁注射液、血必净注射液、参麦注射液、参附注射液、痰热清注射液分别用于热毒犯肺、肺失宣降证以及热毒壅肺、内闭外脱证等。2019年国家卫生健康委员会、国家中医药管理局联合发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行第七版)[8]中分别推荐喜炎平注射液、血必净注射液、热毒宁注射液、痰热清注射液、醒脑静注射液、参附注射液、生脉注射液、参麦注射液等用于普通型气营两燔证、重型或危重型内闭外脱证。可见，TCMI常用于急重症治疗，在我国疫病治疗中发挥着重要作用。

2 中药注射剂的不良反应概况

无论是化药还是中药，与口服药物剂型相比，注射剂发生ADR的风险要高得多。原国家食品药品监督管理总局发布的《国家药品不良反应监测年度报告》（2018年）显示[9]，2018年共收到药品不良反应/事件报告（ADR/ADE）159.7万例次，化学药占83.9%、中药占14.6%。在所有药品ADR/ADE报告中，注射剂占64.2%（其中静脉注射剂占60.0%）、口服制剂占32.2%。在中药ADR/ADE报告中，TCMI和口服制剂的占比分别为49.3%（其中静脉注射剂占48.7%）和43.6%。以往对TCMI的ADR/ADE发生率并不清楚，近年来，有些企业积极开展TCMI的临床集中主动监测研究，对一些常用的TCMI品种的ADR发生情况有了进一步的了解。例如，李晴等[10]基于296 200例TCMI临床安全性集中监测研究数据，发现14种TCMI的总ADR发生率为0.16 %，总体上是偶见水平。另外，研究还发现多数ADR集中发生在用药后60 min内，呈速发型过敏样反应，其中TCMI的ADR临床表现主要为皮肤附件、消化系统、循环系统、呼吸系统和神经系统等的过敏样症状。

国家药品不良反应监测中心基于全国不良反应监测网络所收集的ADR/ADE数据分析用药风险，并向公众发布《药品不良反应信息通报》。从2001年11月至2017年12月共发布了76期《药品不良反应信息通报》，其中共有14期涉及TCMI 16个品种。《药品不良反应信息通报》显示，TCMI的ADR/ADE主要表现为全身皮疹、瘙痒、寒战、发热、腹痛、腹泻、心悸、胸闷等症状，严重者可出现呼吸困难、休克，甚至死亡。以上症状多发生迅速，主要集中发生在首次用药后60 min内[11]，最早可在用药后几分钟发生，与速发型过敏反应类似，故常常被报告为“过敏反应”“过敏样反应”或“I型变态反应”（为了叙述方便，下文将此3类统称为“超敏反应”）。除此之外，极少数品种如穿琥宁注射液、莲必治注射液有血尿、腰痛等报告[12-13]；个别品种如葛根素注射液有溶血性贫血报告[14]。可见，TCMI的ADR是以“超敏反应”为主。

3 中药注射剂的“超敏反应”性质评价

药物超敏反应包括过敏性超敏反应和非过敏性超敏反应。过敏性超敏反应是由免疫机制诱导的超敏反应，即人们通常所说的过敏反应。根据Gell与Coombs提出的分类法，过敏性超敏反应分为四型：速发型（I型）、细胞毒型（Ⅱ型）、免疫复合物型（Ⅲ型）、迟发型或细胞介导型（IV型）[15]。非过敏性超敏反应是指非免疫机制介导的不良反应，也被称为类过敏反应或假过敏反应[16]。速发型过敏反应与类过敏反应在临床上很难区分，因为二者的临床表现非常类似，均表现为用药后短时间内出现皮疹、瘙痒、皮肤黏膜充血或水肿、腹痛、腹泻、恶心、呕吐、寒战、发热、头晕、胸闷、心慌等症状，严重时可出现呼吸困难、血压下降、休克，甚至死亡。然而，速发型过敏反应与类过敏反应发生的机制却有很大的不同。速发型过敏反应是由免疫机制介导，药物为抗原或半抗原；第1次用药不会出现反应症状，只可能刺激机体产生抗体，使机体处于致敏状态；当机体再次接触相同或类似结构药物时，才激发机体产生过敏症状。然而，产生类过敏反应的药物不一定是抗原或半抗原。类过敏反应主要可能是直接刺激肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒，导致组胺或致敏物质释放；或激活血管内皮细胞或其他炎症细胞，释放炎症介质等引起的。类过敏反应不依赖于抗体或致敏淋巴细胞，因此在第1次用药时就可能发生类过敏反应。表1列举了药物速发型过敏反应与类过敏反应的区别。

表 1 药物速发型过敏反应与类过敏反应的异同[17]Table 1 Similarities and differences between drug allergy and drug pseudoallergic reaction

无论是国家药品不良反应自发呈报系统（spontaneous reporting system，SRS）的ADR/ADE报告，还是文献ADR/ADE报道，对TCMI的超敏反应基本上被报道（或报告）为“（速发型）过敏反应”或“I型变态反应”。然而，TCMI超敏反应产生过程并不完全符合过敏反应的发生机制。据临床报道，TCMI的超敏反应在首次用药后发生的情况比较常见。李健[18]、陈文华[19]、王捷[20]、宫涛等[21]分别报道双黄连注射液ADR病例中首次用药后出现反应症状者分别占80.3%、94.7%、88.67%和81%。参麦注射液、脉络宁注射液、黄芪注射液、喜炎平注射液、茵栀黄注射液、清开灵注射液等的ADR也是以超敏反应为主，首次用药出现反应者分 别 占 86.3%[22]、88.3%[23]、66.7%[24]、96.3%[25]、86.2%[26]、90.8%[27]。考虑到首次用药发生反应的高比例特点，故有理由认为TCMI的超敏反应可能不一定是免疫介导的过敏反应，而有可能是类过敏反应。

笔者课题组近年来围绕TCMI超敏反应特点开展临床前实验研究，分别采用过敏实验方法和类过敏实验方法研究了鱼腥草注射液[28]、双黄连注射液[29]等十多种TCMI以及常用注射剂辅料吐温80[30]的超敏反应特点，发现基本上过敏实验结果呈阴性，而在类过敏实验中，可观察到与剂量相关的类过敏反应，结果证明了TCMI引起的是类过敏反应。结合临床报道以及临床前实验研究结果，认为TCMI的超敏反应共性特点主要是类过敏反应，而不是免疫介导的过敏反应。可见，以往长期以来对TCMI的“超敏反应”性质存在误解，将类过敏反应误认为是过敏反应。由于类过敏反应与过敏反应发生机制不同，诱导物质和临床特点也不同，二者的预测方法、临床防治策略以及生产中产品的风险防控技术也应该不同。因此，搞清楚TCMI超敏反应性质对于解决TCMI安全性问题无疑是非常重要的。

4 中药注射剂类过敏反应评价方法

我国现行的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》（2014年颁布实施）适用于中药、天然药物、化学药物。该指导原则规定，注射剂需进行主动全身过敏实验（active systemic anaphylaxis，ASA）和被动皮肤过敏实验（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）。然而该指导原则没有推荐类过敏反应评价方法。经济合作与发展组织（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）和人用药品注册技术国际协调会议（International Conference on Harmonization，ICH）在相关的指导原则中均没有推荐用于注射剂类过敏评价的方法。美国FDA发布的新药产业免疫毒理学评估指南（Guidance for Industry Immunotoxicology Evaluation of Investigation New Drug）指出，在药物过敏实验中如果发现动物出现过敏样反应症状后，可进行进一步实验来区分该过敏样症状出现原因是IgE介导的过敏反应还是类过敏反应，建议可采取肥大细胞检测组胺释放，或采用小型猪检测补体激活潜力。体外肥大细胞组胺释放实验很容易受到操作因素的影响，稳定性和重复性不容易保证。小型猪类过敏实验主要检测的是补体激活导致的类过敏反应，另外，小型猪价格昂贵，饲养设施和饲养管理费用较高，目前主要应用于含聚氧乙烯蓖麻油的化药如紫杉醇注射液、造影剂等的类过敏反应研究，而在TCMI类过敏反应研究中罕见应用[31]。

为了建立适用于TCMI类过敏反应评价的实验模型，笔者课题组根据类过敏反应的临床特点，分别采用小鼠、大鼠和犬进行了模型的研究。考虑到临床类过敏反应症状包括皮疹、皮肤黏膜红肿、胸闷、呼吸困难等与血管通透性增高有关，因此，利用血管通透性增高的定性和定量分析可以作为类过敏反应的评价指标。根据小动物和大动物可观察到的临床表现不同，分别建立了不同的评价类过敏反应的指标[32]。

小鼠[33]和大鼠[34]类过敏反应模型均是根据伊文思蓝（EB）与血浆蛋白具有很高的亲和力的特点，将EB作为血管通透性指示剂。当将EB注射到血管后，EB与血浆白蛋白迅速形成复合物（EBAB），由于血浆蛋白分子较大，如果血管壁完整，EB-AB只会保留在血管内。如果由于药物刺激而导致血管通透性增高，那么EB-AB就会渗漏到血管外，使组织染成蓝色。小鼠的耳廓组织无被毛覆盖，很容易肉眼观察到血管渗出导致的耳廓蓝染。大鼠模型则是在于TCMI为皮内注射给药，模拟临床注射皮试方法给药。单次静脉注射TCMI以后，通过检测渗漏到组织中的EB量，可以评价类过敏反应强弱，类过敏反应越强，EB渗漏越多。该方法还可用于TCMI类过敏反应机制研究。笔者课题组采用这2种模型，研究了双黄连注射液（主要类过敏物质连翘酯苷）、生脉注射液、清开灵注射液等多种TCMI[35]以及紫杉醇注射液[36]、青霉素注射液[37]等化学药注射剂的类过敏反应及其机制，发现该模型检测结果与临床实际情况一致，方法敏感、稳定，重复性很好。另外，该模型成本低廉，操作简便，评价指标客观。犬类过敏反应模型[38]则是采用Beagle犬，单次静脉注射受试药后，观察动物的瘙痒行为学症状，以及皮肤红斑或水肿、恶心、呕吐、流涎、步态等表现，并根据症状轻重评分，判断类过敏反应及其程度。同时，利用清醒动物生理信号监测系统实时监测呼吸、心电、血压等指标，可以发现是否发生呼吸困难、血压下降、休克等。笔者课题组利用该模型，研究了鱼腥草注射液和吐温80的类过敏反应及其机制[28]。

5 中药注射剂类过敏反应风险防控

TCMI有不少是“地方标准升级为国家标准”品种，由于研发时间较早，当时技术要求相对较低，工艺和质量研究以及安全性评价不充分。2000年，原国家药品监督管理局发布实施《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求TCMI品种制定中药材、有效部位或中间体、成品的指纹图谱，以保证质量稳定、可控。2007年颁布了《中药、天然药物注射剂基本技术要求》，对TCMI提出了“689原则”，即：要求有效成分制成的注射剂，其单一成分含量不少于90%；多成分制成的注射剂，总固体中结构明确成分的含量应不少于60%，所测成分应大于总固体量的80%。原料（药材、饮片、提取物、有效部位等）、中间体、制剂均应分别研究建立指纹图谱，并应进行原料、中间体、制剂指纹图谱的相关性研究。经质量研究明确结构的成分，应当在指纹图谱中得到体现，一般不低于已明确成分的90%。这一要求，促进了TCMI生产企业对其产品进行物质基础的系统研究，并采用更高质量标准控制TCMI质量，大大提升了产品均一性、稳定性，也使得产品安全性得到一定程度的改善。然而，由于以往对TCMI类过敏反应缺乏认识，更关键的是缺乏类过敏反应检测模型和评价方法，使得TCMI的致类过敏反应的物质难以发现。因此，即便是通过系统的药学研究满足了“689原则”，并采用全方位指纹图谱和多成分含量测定更好地控制产品均一性和稳定性，但如果不找出致类过敏反应的物质并加以控制，则产品安全性很难得到实质性改善。

鉴于以上问题，笔者课题组以双黄连注射液为代表，建立了一套类过敏物质筛选方法[39]。前期建立的小鼠类过敏反应模型，可以采用较小的样品量、快速进行筛选，同时该模型可以检出体内不同机制产生的类过敏反应，并且检测结果的可重复性很好，因此利用该模型很适合于TCMI的致类过敏反应的物质筛选。通过双黄连注射液系统的化学分离、样品制备，结合小鼠类过敏反应筛选，证明双黄连注射液的致类过敏反应的物质主要与连翘有关。进一步系统分离、制备连翘的不同组分或成分进行筛选，发现连翘酯苷类是双黄连注射液的主要致类过敏反应物质。通过双黄连注射液化学成分分析，发现其含有连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘酯苷E等多种连翘酯苷类成分。进一步对不同的连翘酯苷类成分进行类过敏活性比较，证明连翘酯苷A的致类过敏反应活性最高。为了验证筛选结果，采用化学成分定向敲除方法，去除双黄连注射液中的连翘酯苷A，将双黄连注射液原品与去除了连翘酯苷A后的双黄连注射液进行比较，发现去除连翘酯苷A后基本消除了类过敏反应[29,39]，说明笔者课题组建立的筛选技术可以筛选出并验证致类过敏反应的物质。由于类过敏反应与剂量、浓度等有关，因此，对产品中的致类过敏反应的物质建立适当的限量标准，则可以有效控制其产生类过敏反应的风险。

6 中药注射剂产品的类过敏反应风险控制方法

TCMI生产过程中的全过程风险控制是一个复杂的体系，涉及很多环节。本文仅从产品的类过敏反应检测以及类过敏物质控制2个方面论述类过敏反应风险控制方法。

我国TCMI生产企业在产品出厂前，需要按照《中华人民共和国药典》（2015年版）的“注射剂安全性检查法应用指导原则”对产品进行安全性检查，包括异常毒性、细菌内毒素（或热原）、降压物质、过敏反应、溶血与凝聚等项，企业根据产品风险控制的需要选择相关的项目纳入产品质量控制标准。一般情况下，TCMI生产企业均将过敏反应纳入产品质量标准，并对每批产品进行检查，结果阴性者才可放行出厂销售。然而，如前文所述，TCMI引起的主要是类过敏反应，但是目前对产品类过敏反应缺乏相应的检测方法。因此，笔者课题组与多家企业合作，利用小鼠类过敏反应模型，针对不同产品分别建立了小鼠类过敏反应检测法。按照生物学检测法的原则，从方法的专属性、灵敏度、可重复性、检测体系的可靠性、稳定性和适用性等方面，进行了系统的方法学考察，形成标准操作程序（SOP）便于企业药品检验人员操作和使用。目前有的企业已经将小鼠类过敏反应检测法纳入到产品内控标准，成为产品风险控制的重要手段[38]。该方法可在TCMI产品生产过程中实现对产品致类过敏反应风险的快速监测，及时识别和控制产品风险，提高产品的安全性。

致类过敏反应物质的控制是TCMI产品类过敏反应风险控制的另一个关键点。实现类过敏物质的控制前提是要筛选并明确致类过敏反应物质，前文已介绍了致类过敏反应物质的筛选方法，因此找出致类过敏反应物质是可能的。明确致类过敏反应物质后，如何在不影响关键工艺的前提下实现致类过敏反应物质的控制则是企业需要下功夫解决的关键问题。笔者课题组以双黄连注射液为例，探讨了这一问题的解决方案。前期笔者课题组已经证明连翘酯苷A是双黄连注射液的主要致类过敏反应物质[39-40]，其致类过敏反应具有剂量关系，因此，可以找出无类过敏反应的最高剂量。笔者课题组对双黄连中的连翘酯苷A进行检测，发现在产品中其含量较高，但并没有含量测定标准。目前没有研究证据表明，连翘酯苷A是否是双黄连注射液的有效成分。因此，企业有必要对双黄连注射液中的连翘酯苷A与药效的关系进行研究，明确产品中连翘酯苷A的作用。如果其有一定药效作用并且有量效关系，则可结合连翘酯苷A引起类过敏反应的量效关系，确定产品中连翘酯苷A的合理含量范围，作为制定产品中连翘酯苷A限量的依据。在双黄连注射液生产中，不同企业对连翘的投料方式有所不同，老翘与青翘混用的情况比较普遍。笔者课题组前期研究发现，青翘中的连翘酯苷A含量较老翘高，其造成的类过敏反应也较高[39]。因此，可以通过连翘原料药材的选择，在满足其他质量标准的情况下，兼顾连翘酯苷A的合理含量，来选择适宜的药材原料。

目前国内市场上的TCMI在临床前或上市后均按照《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光敏性）研究的技术原则》《中药注射剂安全性检查法应用指导原则》《过敏反应检查法》进行过I型过敏反应的筛查，但假阴性极高，说明目前传统的过敏反应检测方法可能不能完全适用于TCMI的过敏反应的筛查。随着科学研究的不断进步，目前对于致敏原的检测方法也越来越精准高效，基于TCMI具有复杂成分的特点，文雯等[41]采用免疫指纹图谱法，以酶联免疫吸附法（ELISA）结合液质联用技术（HPLC/MS）筛查双黄连注射液的致敏性成分，结果提示双黄连注射液可引起大鼠产生I型超敏反应。笔者课题组也对大量TCMI是否诱发动物发生I型过敏反应进行筛查，但并没发现有TCMI明确诱发I型过敏反应的证据。

总之，TCMI的安全性备受社会广泛关注，为广大人民群众提供安全性更高的中药产品是中医药行业从业人员的责任和义务。应该针对TCMI可能产生风险各个环节，加强基础研究以提升风险识别和控制能力，持续改进产品质量，建立更为完善的风险防控技术体系，以保证患者的用药安全。