超高压对大鲵黏液中水解酶活性与粘性的影响

董梦尧, 陈德经, 裴金金, 曾允灏, 雷 娇

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001； 2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723001)

大鲵(Andriasdavidianus)属两栖纲有尾目隐鳃鲵科。大鲵皮肤腺体主要有粘液腺(mucus gland)和颗粒腺(granular gland)2种[1],粘液腺分泌出清澈黏液，覆盖在身体表面形成一层湿润的薄膜，具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、pH调节等作用[2-3]；颗粒腺又叫毒腺，在皮肤局部聚集形成特殊的腺体结构，能够分泌抗菌肽和药理活性肽等生物活性物质[4-5]。大鲵黏液中有许多活性成分，其中糖蛋白中总糖含量为4.23%，蛋白质含量为61.86%[6]。徐伟良等[1]通过邻苯三酚自氧化法、DPPH法以及小鼠灌胃毒性检测到大鲵黏液具有抗氧化性和低毒性，脱毒后可开发为保健品。大鲵黏液由于具有粘性和抗氧化性，可以用于制造医药粘合剂；以粘蛋白生产的天然粘合剂具有良好的生物相容性，可开发为生物粘合剂[7]。水产动物、植物中存在大量水解酶。朱蓓薇等[8]采用硫酸铵分级盐析、Sephadex-100分子筛柱层析方法对海参自溶酶进行分离纯化发现，纯化的酶为酸性蛋白酶，对热不稳定且不同的金属离子(如Mn2+、Zn2+)对酶的活性有抑制或激活作用。曾绍桥等[9]采用超高压处理海参发现，海参自溶酶的蛋白酶活力随压力的增加而下降，当压力大于200 MPa时蛋白酶活力被显著抑制。大鲵黏液作为生物粘合剂材料，采集后很快水解而粘性降低。为保持大鲵黏液的粘性，采用超高压使酶失活并实现冷杀菌,研究其对黏液粘性的影响，以期为大鲵黏液生物粘合剂的制备奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大鲵黏液采自实验室自养大鲵。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铵、氯化钠、三氯乙酸、碳酸钠、酪蛋白及Folin-酚试剂均购于合肥博美生物科技有限公司；蛋白Mark(PM2510)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸、巯基乙醇及甘油均购置于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鲵黏液溶解液筛选 刮取新鲜大鲵黏液，按黏液∶溶剂=1∶5的比例于20℃条件下溶解于水、乙酸、氢氧化钠及抗坏血酸(Vc)中5 h，采用磁力搅拌器、超声波、38℃水浴锅恒温加热等方法辅助溶解，记录大鲵黏液的溶解情况，根据溶解前后黏液干重的比例计算溶解度。

1.2.2 大鲵黏液粘度及变化测定 取大鲵鲜黏液、冻干黏液粉末各1.00 g，采用磁力搅拌器辅助加快溶解，将大鲵黏液溶解于1.2.1选出的最佳溶解液中，SNB-2粘度计测量黏液的粘性。根据新鲜黏液的粘度大小选择最佳溶解液，测定1.00 g新鲜黏液在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h及5 h的粘度和在每个时刻析出的水分占所刮取的黏液的体积比。

1.2.3 水解酶活力的测定

1) 大鲵黏液中水解酶的制备。参照朱蓓薇等[8]自溶酶的测定方法。取大鲵鲜黏液、冻干黏液粉末各10.00 g，按1∶4(大鲵黏液质量比/磷酸盐缓冲液体积)加入0.10 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.3)，浸提，4℃静置过夜存放备用。

2) 标准酪氨酸曲线的建立。准确称取L-酪氨酸100.00 mg于105℃的烘箱中烘干3 h，溶于60.00 mL 0.10 mol/L HCl溶液中，再用去离子水准确定容至1 L容量瓶中，得酪氨酸溶液100.00 μg/L，并依次稀释为10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、30.00 μg/mL、40.00 μg/mL、50.00 μg/mL、70.00 μg/mL、80.00 μg/mL的酪氨酸溶液。移取各浓度溶液1.00 mL于一系列试管中，在40℃恒温水浴中预热5 min，各取1.0%酪蛋白溶液2.00 mL加入试管中，保温10 min，立即加入2.00 mL 5%三氯乙酸溶液，使蛋白变性，终止反应，4 000 r/min离心8 min。取1.00 mL上清液于试管中，依次加入0.55 mol/L Na2CO3溶液5.00 mL和 Folin-酚试剂0.50 mL，摇匀，显色15 min。在650 nm下，用722分光光度计测定吸光度(OD值)。以OD值为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标作标准曲线，计算K值。

3) 水解酶活力的测定。吸取1.00 mL配制好的大鲵鲜黏液和冻干黏液的粗酶液，称重(m)，加入9.00 mL的蒸馏水，稀释10倍。吸取1.00 mL稀释酶液到试管中。按照测定酪氨酸浓度的方法测定大鲵鲜黏液与冻干粉中的酪氨酸浓度，3次重复，取平均值，计算酶活力。

X=(◎×5×n)/10m

式中，X为酶活力，◎为根据测定的光密度值在标准曲线上查得相应的酪蛋白的微克数；5为反应的总体积；10为反应时间10min；n为酶稀释倍数；m为样品质量(g)。

1.2.4 酶分子量测定 参照林方养等[10-11]的方法测定，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，选取12%分离胶，5%浓缩胶，蛋白Marker为PM2510，分子量为10～180 kDa。

1.2.5 影响水解酶活性及黏液粘性的因素测定

1) 压力。准确称取1.00 g大鲵新鲜黏液6份，分别放入真空袋抽真空后放入0.10 MPa、100 MPa、200 MPa、300 MPa、400 MPa、500 MPa下保压30 min，取出后溶解于pH 6.3的磷酸盐缓冲液， 4℃下磁力搅拌辅助提取，测酶活力和黏液粘性。

2) 温度。取5组1.00 g的大鲵黏液，分别置于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃水浴30 min，取2等份黏液，1份溶于磷酸盐缓冲液测定水解酶活性，另一份测定黏液粘性。

1.2.6 超高压对大鲵黏液的抑菌测定 分别取1.00 g的大鲵黏液放入真空袋抽真空后放入100 MPa、200 MPa、300 MPa、400 MPa、500 MPa下保压30 min，再以0.10 MPa下1.00 g黏液作为对照，参照食品微生物学检验标准[12]检测6种压力情况下各样品的菌落总数，判断超高压对大鲵黏液的抑菌效果，计算菌落致死率。

致死率=(未处理样品的菌落总数-处理样品后的菌落总数)/未处理样品的菌落总数×100%

1.3 数据分析

用Origin 8.5、Excel对试验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 大鲵黏液的溶解度

由表1可知，大鲵黏液难溶于水，溶解度低，仅为5.06 mol/L；易溶于乙酸、Vc及氢氧化钠溶液，以在0.75 mol/L 乙酸溶液和0.75 mol/L Vc溶液中的溶解度最高。乙酸和氢氧化钠有一定的酸度和碱度，对人体皮肤有一定的损害作用，Vc为弱酸溶液，有一定的抗氧化作用，在人体氧化代谢中可促进胶原及结缔组织的合成、促进伤口愈合，清除自由基。故制造生物粘合剂时宜选择0.75 mol/L Vc为溶解液。

2.2 大鲵黏液粘度

从表2看出，大鲵黏液在乙酸溶液和Vc溶液中的粘性和流出时间相差不大。从图1看出，以Vc作溶解液，在常温下随着大鲵黏液放置时间的增加，水解液所占黏液总重的百分比不断增大，黏液粘度不断减小，说明水解液的流出对于粘性有一定的影响。

2.3 大鲵黏液水解酶的活性

绘制的酪氨酸酶的标准曲线为Y=0.004 4X+0.437 4。由图2可知，水解酶活性新鲜黏液中的(95.23 U/mg)高于冻干后的(82.50 U/mg)，表明冻干的大鲵黏液能够很好地保持其酶活性，且不具有明显的抑制作用。

2.4 水解酶的蛋白分子量

从图3看出，对比标品Mark分子量，可知大鲵黏液水解酶粗提液中的水解酶的分子量区间有30 kDa、36 kDa、43 kDa、140 kDa和180 kDa。根据条带亮度可知，分子量在25～35 kDa、140～180 kDa的蛋白水解酶含量较多，为主要水解酶。

表1 大鲵黏液在不同溶剂中的溶解度

表2 大鲵黏液溶解液的粘性

2.5 超高压和温度对大鲵黏液水解酶活性及粘性的影响

2.5.1 压力 从图4看出，随着压力的增加，酶活降低。原因是压力破坏黏液中水解酶的结构，导致酶失活，压力越高，酶活越低，当压力处于200 MPa时酶活已经趋近于0。因保压30 min时酶活性基本缺失，因此不需再作保压时间影响探究。大鲵黏液粘性随着压力的增加而降低，在200 MPa之后基本趋于稳定。与常压下新鲜黏液相比，粘性降低1.67%，但对于大鲵黏液粘性起到了很好的稳定效果。说明，压力能够有效地抑制酶活力，大鲵黏液粘性变化不大。

2.5.2 温度 从图5看出，大鲵黏液水解酶的活力和粘度均随着温度的升高面下降。在25～35℃时大鲵黏液水解酶的活力较高，是因为此温度区间是酶的最适温度；25℃时，大鲵黏液水解酶的活力即为最大值，随着温度升高，酶的活力逐渐降低，且在60℃时酶基本失活。故最适水解酶生存温度为25℃。而60℃下菌落无法完全灭活，因此不对几种温度下大鲵黏液中菌落总数进行探讨。60℃后大鲵黏液水解酶的粘度下降46.44%。

2.6 超高压对大鲵黏液抑菌活性的影响

从图6看出，高压处理后大鲵黏液中菌落总数较未处理的明显降低，且菌落总数随着压力的升高而减小， 500 MPa下致死率达98.5%。说明，超高压能极好地抑制大鲵黏液中菌落的生长。

3 结论与讨论

研究表明，大鲵黏液易溶解于Vc溶液与乙酸溶液，在Vc溶液与乙酸溶液浓度均为0.75 mol/L时，溶解度分别为99.4%和98.4%。在制作生物粘合剂时，因为乙酸和碱性溶解对人体皮肤有刺激作用，而选用有抗氧化、清除自由基作用的Vc溶液作为最佳溶解液。超高压处理的理论基础主要为Pascal原理和Lechatelier原理，在处理食品时，分子构象改变和化学反应平衡等都会向着体积减少的方向发展，超高压处理时通过对菌体蛋白种的非共价键进行破坏，如离子键、二硫键等，破坏蛋白质的高级结构进而使酶失活，蛋白质凝固，能使菌体内的化学组出现外流等多种细胞损伤，造成菌体细胞膜破裂，还能对DNA等遗传物质的复制形成影响，从而杀死微生物[13]。压力也会改变介质的pH，缩小微生物的生长空间[14]，较大压力下也会杀灭大肠杆菌。超高压技术近几年来广泛应用于农产品及水产品的加工、保藏、冷冻等，能够充分保存产品营养成分，抑制菌体微生物生长[15]。大鲵黏液中存在活性较高的水解酶，鲜黏液的酶活性比冻干后的酶活性略高，利用超高压技术处理大鲵新鲜黏液，能抑制水解酶的活性，降低水解酶水解粘性蛋白多肽键的能力，从而使粘性趋于稳定，也可有效杀灭微生物，保持黏液的卫生。

利用超高压处理大鲵黏液可有效抑制黏液中水解酶活性，保持粘性且抑菌性好，将经高压处理后的大鲵黏液溶于Vc能得到粘性极好的溶解液，可用于生产粘性极好、储藏不受影响的生物类医药粘合剂、粘合膜，为生物粘合剂的开发提供依据与借鉴，推动大鲵黏液的高值化加工利用。