芒果苷-Soluplus聚合物胶束的处方研究

胡丽玲

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 药学部， 湖北 宜昌 443003)

芒果苷(mangiferin，MGF)为双苯并吡喃酮结构的碳糖苷(见图1)，富含于高等植物和芒果果实的不同部位，如果皮、茎、叶、树皮、果仁和果核等[1]。其具有抗病毒、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗衰老、免疫调节、保肝、镇痛等多种功能，是一种极具发展前景的抗氧化剂[2-4]。然而，芒果苷不易溶解，生物利用度低，据报道，芒果苷的溶解度为0.111 mg/mL，口服生物利用度仅为1.2%，从而限制了其临床应用，且目前还没有相关产品上市[5]。

聚合物胶束是一种倍受关注的新型给药系统，通过核-壳结构中的疏水性内核包载疏水性药物，从而增加载药范围、增加药物的稳定性、提高药物组织渗透性并延长药物体内滞留时间[6]。由于胶束为纳米制剂，可通过肿瘤组织的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)在肿瘤部位蓄积，实现药物的靶向性，是很有发展前景的药物载体[7]。目前尚无芒果苷聚合物胶束研究的相关报道。本研究旨在探索其制备处方，为芒果苷聚合物胶束的新药开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

MGF购自武汉市合中生化制造有限公司；芒果苷标准品(mangiferin RS)(中国药品生物制品检定所，纯度98.4%，批号111607-200402)；甲醇(methy alcohol，MeOH) (色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；乙腈(acetonitrile)(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；无水乙醇(ethanol) (分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；冰醋酸(glacial acetic acid，HAc)(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)； 1,2-丙二醇(1,2 propylene glycol, 1,2-PG)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(potassium dihydrogen phosphate)(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；磷酸氢二钾(dipotassium phosphate)(分析纯，广东汕头市西陇化工厂)；四氢呋喃( tetrahydrofuran, THF)(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)；乙酸乙酯(ethyl acetate, EtAc) (分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；氯仿(cloroform)(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；盐酸(HCl)(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide, DMF)(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；正辛醇(octanol)(分析纯，天津博迪化工股份有限公司)；葡甲胺(meglumine) (分析纯，阿拉丁)；15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(HS-15)(分析纯，BASF，德国)；氢化蓖麻油(RH40)(分析纯，BASF，德国)；泊洛沙姆F68 (分析纯，BASF，德国)；D-α生育酚聚乙二醇 1000 琥珀酸酯(TPGS)(分析纯，EASTMAN，美国)；聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)(分析纯，BASF，德国)。

1.2 仪器

光学显微镜(Motic R107M，中国)；离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司，中国)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司，中国)；KQ5200E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，中国)；WG-71电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司，中国)；pHS-2C型酸度计(上海伟业仪器厂，中国)；BSA124S电子分析天平(赛多利斯，德国)；UV5100紫外/可见分光光度计(安徽皖仪股份有限公司，中国)；DF-101S集热式磁力加热搅拌器(金坛市医疗仪器厂，中国)；SZ-93自动双重蒸水器(上海亚荣生化仪器厂，中国)；高效液相色谱系统(L-7110输液泵、L-7420紫外检测器，Hitachi，日本)；PY000202加热磁力搅拌(IKAR，德国)；ZHWY-110X30往返式水浴恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司，中国)；红外光谱仪(Bruker，德国)。

1.3 芒果苷原料药预处理

芒果苷原料药用研钵研细，过300目筛，60℃烘干，置真空干燥器中备用。

1.4 芒果苷检测波长的确定

以甲醇为溶媒配制适宜浓度的芒果苷标准品溶液和芒果苷原料药溶液，于紫外-可见分光光度计200～600 nm波长扫描。

配置0.01%Soluplus、0.1%Soluplus、1.0%Soluplus、1.0%F68、1.0%HS15、1.0%RH40、1.0%TPPGS水溶液，于紫外-可见分光光度计200～600 nm波长扫描。

1.5 芒果苷检测条件的确定

精确称取芒果苷标准品50 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇定容，取适量溶液离心，取上清液，高效液相色谱法检测；同理，准确称取适量原料药，甲醇定容，高效液相色谱法测定浓度。色谱条件：C18色谱柱(Haito Pack ODS，5 μm，100 mm×4.6 mm)；流动相为乙腈：0.1%冰醋酸(16:84)；检测波长365 nm；进样量20 μL；流速1.0 mL/min。

1.6 芒果苷标准曲线的建立

精密称取芒果苷标准品1.080 mg，10 mL容量瓶，DMF溶解定容，制备成芒果苷标准品储备液。精密移取芒果苷储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、1 mL，于10 mL容量瓶中，DMF定容，分别制备出浓度为10.8 μg/mL、21.6 μg/mL、43.2 μg/mL、54 μg/mL、64.8 μg/mL、108 μg/mL的芒果苷溶液。高效液相色谱法测定芒果苷峰面积，同前述色谱条件。

1.7 精密度实验

精密移取芒果苷储备液适量，用DMF稀释配制低、中、高 3 个浓度的对照品溶液(10.8 μg/mL、54 μg/mL、108 μg/mL)，按前述色谱条件进样，测定峰面积，连续测定3 d，每天连续测定3次，计算日内精密度和日间精密度。

1.8 回收率实验

精密吸取相应比例的空白聚合物胶束溶液各3份，加入芒果苷储备液，用DMF分别稀释至浓度10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL，按前述色谱条件进样，测定峰面积。代入标准曲线方程计算回收率。

1.9 芒果苷表观溶解度测定

研究芒果苷在不同体系当中的溶解度，取芒果苷适量，各溶剂体积为2 mL，超声配制成悬浊液，间隔2 h超声5 min，至24 h后，各取1 mL溶液于1.5 mL离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液稀释至适宜浓度，高效液相色谱法同前述色谱条件。

1.10 芒果苷的油水分配系数测定

1.10.1 制备正辛醇饱和的水和水饱和的正辛醇

取适量双重蒸馏水以及pH值分别为2、4、6、8的PBS，分别与正辛醇(1∶1，v/v)混合，于50 mL离心管中，水浴摇床，100 r/min，37℃下振摇24 h，充分混合，分别得到水饱和的正辛醇与正辛醇饱和的各pH值的水相；停止振摇，静置，待两相分层后，将注射器吸满空气后，针头伸入下层水相中，排出空气，吸取水相，注射器移出，拔掉针头，得到未被正辛醇污染的水相，离心取上清液。收好两相备用。

1.10.2 芒果苷-水饱和正辛醇溶液的制备

取过量芒果苷于水饱和的正辛醇中，水浴摇床37℃，100 r/min，振摇24 h，得芒果苷的水饱和正辛醇溶液。保留适量该溶液，用于测量水饱和正辛醇中芒果苷总浓度C。

1.10.3 油水分配系数的测定

将适量正辛醇饱和的水加入到“(2)”制备得到的芒果苷-水饱和正辛醇溶液中(1∶1，v/v)，37℃水浴摇床，100 r/min，充分振摇24 h，取下层水相[操作方法同“1.10.1”]，得到经过油水分配后的芒果苷水溶液，离心取上清液，用于测量水相中芒果苷浓度Cw，Co=C-Cw，油水分配系数Po/w= Co/Cw。

1.11 芒果苷-Soluplus胶束的制备

1.11.1 空白胶束的制备

称取100 mg的Soluplus，加入适量双重蒸馏水，磁力搅拌至完全溶解。Soluplus在水中缓慢溶解，搅拌1 h后，溶液带有蓝色乳光，丁达尔效应显著。

1.11.2 芒果苷-Soluplus胶束的制备

以上述溶解性实验为依据，考察不同的溶剂(水、甲醇等)、不同表面活性剂(RH40、TPGS)、不同Soluplus用量，对胶束形成以及芒果苷含量的影响。向各组分中加入略过量的芒果苷，磁力搅拌24 h，得到各比例芒果苷胶束溶液。采用高效液相色谱法，测定芒果苷含量，色谱条件同前。

2 结果

2.1 芒果苷的波长测定

由图2A可知，芒果苷λmax为259 nm，芒果苷原料药纯度基本符合标准。同时，从图中可知芒果苷在λ319 nm和λ365 nm处也有紫外吸收峰。由图2B可知，辅料在芒果苷最大吸收波长λmax259 nm处，均有不同程度的吸收。

除1%Soluplus溶液外，其余含量1%的辅料溶液在该波长紫外吸收几乎为零，可忽略辅料吸收的影响，而1%Soluplus溶液经过稀释10倍、100倍后紫外吸收明显降低，可以忽略。由此，确定芒果苷的测定波长为λ365 nm。后续实验中所涉及到的Soluplus溶液均进行适宜倍数的稀释，再进行测定。

2.2 芒果苷液相专属性图谱

由图3可见，在“1.5”项色谱条件下，芒果苷标准品色谱与原料药色谱在相应保留时间处有一相同的色谱峰，峰形良好。

2.3 芒果苷的含量测定结果

芒果苷浓度在10 μg/mL～110 μg/mL时，线性相关性良好，回归方程为y=22 730x-98 694(R2=0.998 1)，结果见图4。日内精密度RSD分别为0.98%、1.37%、1.04%，日间精密度RSD分别为1.09%、1.12%、0.97%，精密度符合方法学要求。低、中、高3个浓度的回收率分别为106.55%、99.72%、101.23%，RSD为0.85%、0.53%、0.36%(n=3)，表明回收率符合方法学要求。

2.4 芒果苷的表观溶解度

在乙腈、氯仿、乙酸乙酯等低极性或非极性有机溶剂中，高效液相色谱法检测时，芒果苷无检测峰出现(见图5A)，说明芒果苷在此类溶剂中的溶解度低。在不同pH水溶液实验组中，芒果苷溶解度受pH的影响较大(见图5B)，尤其是pH为8时，溶液呈亮黄色，粘稠状。向芒果苷水溶液加入表面活性成分，结果发现RH40和TPGS的增溶效果较好，可应用于后续实验(见图5C)。芒果苷与Soluplus的水溶液，具有胶束的淡蓝色乳光，有丁达尔效应，呈现胶束状态(见图5D)，提示芒果苷含量较高。

2.5 芒果苷的油水分配系数

芒果苷的溶解性受溶液pH的影响很大。低pH值时，芒果苷为游离形式，脂溶性强；高pH值时，芒果苷为离子形式，水溶性强，见表1。

2.6 芒果苷-Soluplus胶束中芒果苷含量

实验结果显示，Soluplus含量0.5%～3.0%的水溶液中，含量为2.5%时，对芒果苷增溶效果最明显(见图6)，因此确定Soluplus含量为2.5%。当甲醇作为溶剂时，虽然芒果苷溶解度很高，但是Soluplus完全溶解，溶液透明，无乳光以及丁达尔效应，不能形成胶束，甲醇不适合作为溶剂使用。TPGS前后增溶效果不明显，无继续使用的价值，而RH40效果较好，可加入少量RH40增溶。

表1 芒果苷在不同酸碱度下的Po/w值和log Po/w值

3 讨论

聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)，由13%聚乙二醇6000、57%乙烯基己内酰胺和30%乙酸乙烯酯共聚而成(化学结构式见图7)，是一种较新的赋形剂[8]。其最初是为了通过热熔挤出技术制造难溶性药物的固体溶液而设计的[9]，具有很强的固体特性和两亲性，平均分子量90 000 g/mol～140 000 g/mol[10]。Soluplus毒性低、安全性好，具有增溶、助悬、空间稳定等作用，在提高难溶性药物溶出速率和生物利用度等方面展示出良好的应用前景。目前已有多篇文献报告了Soluplus在聚合物胶束、固体分散体、药物纳米晶体、过饱和自乳化给药系统等领域中的应用[10-12]。

芒果苷溶解性随溶剂极性变化而变化，波动较大，易溶于极性溶剂，难溶或不溶于非极性溶剂[5]。有研究报道THF对难溶性药物具有增溶作用[13,14]，本研究显示芒果苷在THF中溶解较好，可能与芒果苷中的羟基与THF中的氧原子结合成氢键有关。在不同pH水溶液实验组中，芒果苷溶解度受pH的影响较大，可能与芒果苷的游离形式和成盐有关，芒果苷的酚羟基具有一定的酸性，可与碱成盐，溶解性大大提高[15]。

Soluplus分散在水中时，可自我聚集形成胶束，胶束的核心是由聚乙烯己内酰胺和聚乙酸乙烯酯组成的疏水段，而由聚乙二醇组成的亲水段则延伸至水相。本实验结果显示，当在Soluplus胶束中加入芒果苷诱导初始过饱和时，游离药物分子缓慢扩散到疏水性胶束核，使疏水性药物芒果苷溶解增加。当在Soluplus胶束中加入RH40后，芒果苷的溶解度可进一步增加，这可能是由于分子间相互作用强烈，单纯的Soluplus胶束可能非常坚硬，药物分子不易扩散至Soluplus胶束的疏水空间。当RH40加入到水溶液中，随着浓度的增加，RH40持续扩散到疏水的胶束芯中，吸附在疏水的片段上形成小团簇，直到两亲性聚合物达到饱和，使Soluplus胶束崩解形成RH40-Soluplus络合物，增加胶束的柔软性，使芒果苷较易扩散至胶束内核而增加溶解度[11]。

本实验建立了芒果苷准确可靠的分析方法，研究了不同辅料对芒果苷的增溶效果，为进一步研究芒果苷-Soluplus-RH40聚合物胶束奠定了基础。