PWL基因家族在黑龙江省水稻稻瘟病菌中的分布与变异

孟峰 靳学慧 张亚玲

摘要 根据已公布的PWL家族基因序列设计4对特异性引物，对329个采自2016年及2017年黑龙江省各稻区的水稻稻瘟病菌单孢菌株DNA进行PCR扩增与序列分析，研究了水稻稻瘟病菌中PWL家族基因的组成及变异特征。结果显示，PWL2与PWL4在黑龙江省各稻区稻瘟菌中均有分布且稳定存在，出现频率分别为73.86%与73.25%;PWL3出现频率为40.73%;PWL1在329个菌株DNA中均未扩增出目的条带，再次验证了PWL1在水稻的稻瘟病菌中显示为完全缺失。对部分菌株的PCR产物进行测序分析发现，PWL2、PWL3和PWL4基因编码区在黑龙江省水稻稻瘟病菌株中的主要变异为点突变，且引起氨基酸的突变。

关键词 黑龙江省; 水稻稻瘟病菌; PWL基因家族

中图分类号： S 435.111.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019432

Abstract Four pairs of specific primers were designed based on the published sequences of the PWL gene family. The DNAs of 329 isolates of rice blast fungi isolated from different rice regions in Heilongjiang province in 2016 and 2017 were used as templates to amplify and sequence the target genes by PCR. The composition and variation of the PWL gene family in rice blast fungi were studied. The results showed that PWL2 and PWL4 were distributed and existed stably in all rice areas of Heilongjiang with an occurrence frequency of 73.86% and 73.25%， respectively. The frequency of PWL3 was 40.73%. The target band of PWL1 could not be amplified from 329 strains， confirming that the PWL1 gene was completely deleted in the rice blast fungi tested. Sequencing analysis of the PCR products of some strains showed that the main mutations of PWL2， PWL3 and PWL4 genes in physiological races of rice blast in Heilongjiang were point mutations with abundant mutation sites leading to amino acid mutations.

Key words Heilongjiang province; Magnaporthe oryzae; PWL gene family

稻瘟病菌Magnaporthe oryzae B.Couch引起的稻瘟病是世界水稻生產中最具有毁灭性的病害之一[1-2]，稻瘟病菌变异快，导致抗病品种应用3～5年后便“丧失”抗性，变为高度的感病品种。稻瘟病系统是一个经典的基因对基因系统[3]，只有在稻瘟病菌的无毒基因与寄主的抗性基因相互作用时，水稻品种才能表现出抗瘟性[4]。据不完全统计，目前已有12个无毒基因被克隆，包括PWL2、PWL1、AVR-Pita、ACE1、Avr1-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pia、AVR-Pii、AVR-Pik/kp/km、AVR-Pi9、PWL2D和AVR-Pib[5-14]。其中PWL1、PWL2属于PWL基因家族，该家族包含4个成员，PWL1、PWL2、PWL3和PWL4[6]。PWL2是最早被克隆的稻瘟病菌无毒基因[5]，有很强的寄主特异性。PWL1来源于龙爪稷病原菌WGG-FA40，也有寄主特异性，氨基酸序列与PWL2有75%相似[5]。PWL3和PWL4在正常情况下是没有功能的，分别与PWL2有51%和57%的同源性，PWL4要在PWL1或PWL2的启动子启动下才会表现出阻止侵染画眉草的功能。而PWL3在弯叶画眉草中无毒功能丧失。PWL家族编码的蛋白有以下共同特征：末端甘氨酸序列具有真核生物序列的共同特征，均是亲水性蛋白且甘氨酸位点在整个蛋白中均匀分布。穆慧敏等[15]对PWL1、PWL2、PWL3和PWL4进行分布与变异的分析，结果显示PWL家族的主要变异为缺失，并且具有丰富的扩增多态性;张崎峰等[16]对2006年黑龙江省19个稻区204个稻瘟病菌菌株的DNA进行PCR扩增，结果显示PWL2出现频率为52.94%，PWL3出现频率为0。张科等[17]对2015年黑龙江省7块田中采集的124个稻瘟病菌菌株DNA进行PCR扩增检测，结果表明PWL2出现频率为72.8%，PWL3出现频率为66.7%。本研究结合PWL家族的基因扩增与测序结果，对黑龙江省2016年及2017年不同稻区的水稻稻瘟病菌进行分析，研究不同菌株中PWL家族的分布与变异情况。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

2016年和2017年在黑龙江省10个市19个县水稻种植区内采集稻瘟病穗颈瘟标样，经单孢分离获得单孢菌株329个（2016年127个菌株，2017年202个菌株）（表1）。

1.2 稻瘟病菌基因组DNA提取

将分离的稻瘟病菌单孢菌株于PDA培养基上培养，取适量菌丝块放在酵母液体培养基中，于28℃摇床，120 r/min 振荡3～5 d，将菌丝体分别置于1.5 mL离心管中，使用真菌DNA提取试剂盒（D3390-01 Omega Bio-Tek公司）提取稻瘟病菌基因组DNA，微量分光光度计测定DNA浓度，并将DNA原液稀释成60 ng/μL的工作液备用。

1.3 引物设计

于NCBI上查找PWL1、PWL2、PWL3基因序列，在CDS区设计3对特异性引物，PWL4引物序列参照穆慧敏等[15]的CDS区序列。4对序列均委托上海生工生物工程技术有限公司合成（表2）。

1.4 PCR扩增及电泳检测

PCR反应体系（20 μL）：rTaq酶0.1 μL，dNTPs 1.6 μL（各2.5 mmol/L），10×Buffer（Mg+）2.0 μL，正反向引物各0.3 μL，DNA模板1 μL，超纯水补足20 μL。扩增程序：94℃预变性3 min;94℃变性45 s，55～60℃退火45 s，72℃延伸30～90 s，32个循环;72℃延伸10 min，4℃保存待检测。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳150 V，20 min，电泳液为 0.5×TBE，在电泳成像系统下拍照并统计无毒基因出现频率。

1.5 无毒基因的基因序列测序分析

在黑龙江省2016年和2017年的稻瘟病菌菌株中挑选包含所有地区的部分菌株（60株）送上海生物工程技术有限公司测序，测序结果采用DNAMAN软件对核苷酸的序列进行比对分析，并通过MEGA7软件对PWL家族构建系统发育树以确认变异类型。

2 结果与分析

2.1 PWL家族在黑龙江省稻瘟病菌生理小种中的分布

以水稻稻瘟病菌329个菌株的DNA为模板，根据PWL家族序列设计的引物（表2）来进行PCR检测（图1）。结果显示，PWL1在所有供试DNA中均未检测到目的片段，频率为0;PWL2在243个DNA中检测出目的片段，出现频率为73.86%;PWL3在134个菌株DNA中扩增出目的条带，出现频率为40.73%;PWL4在241个DNA中检测到目的条带，出现频率为73.25%（表3）。

2.2 PWL家族基因的序列分析

2.2.1 PWL2基因的序列分析

从243个扩增出目的条带的菌株中挑选涵盖所有地区的20个菌株测序。将测序的PWL2序列与已克隆的PWL2序列比对，结果显示，20个菌株的PWL2碱基序列可分为5类，第一类与已克隆的PWL2基因序列完全一致;第二类与已克隆的基因序列比对有1处差异，即268（A/G），本试验将该种类命名为PWL2-1;第三类与已克隆的序列比对有4处差异，即64（T/G）、65 T（插入）、268（A/G）、398（T/G），将该类命名为PWL2-2;第四类与已克隆的序列比对有3处差异，即142（T/A）、143 T（插入）、268（A/G），本试验将其命名为PWL2-3;第五类与已克隆的序列比对差异较大，有16处差异，52（G/T）、65 T（插入）、99 C （缺失）、107（G/A）、108（G/A）、150（G/T）、151（A/T）、152（A/T）、154 G（插入）、220（T/A）、221 C（插入）、223（T/C）、224（T/C）、225（A/G）、228（A/G）、229 A（插入），將该类命名为PWL2-4（图2）。

PWL2的5类碱基所翻译氨基酸与已克隆的氨基酸序列比对结果见图3，PWL2-1序列存在一处错义突变，即90（Y/D）;而PWL2-2与PWL2-4均在22位处开始出现突变，PWL2-3在49位处出现突变，PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4均导致翻译提前终止。

2.2.2 PWL3基因的序列分析

从134个扩增出目的条带的菌株中挑选涵盖所有地区的20个菌株测序。将测序得到的PWL3与已克隆的PWL3序列比对。结果显示，20个菌株的PWL3碱基序列可分为5类，一类为与已克隆的PWL3基因序列完全一致;其他4类其差异主要体现在305 T（缺失）、367（A/G）、404（C/A）、412（A/C）、413（T/G）和415（G/C）。其中有碱基的差异和上述6处差异相同，本试验命名为PWL3-1;第三类与PWL3-1相比在167位处增加了碱基C的插入，本试验将其命名为PWL3-2;第四类与PWL3-1相比又增加了6处差异，即155 A（插入）、161 G（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入）和184 C（插入），本研究将其命名为PWL3-3;第五类与PWL3-1相比又多有4处差异，即155 A（插入）、162 A（插入）、163（C/A）、167 C（插入），本试验命名为PWL3-4（图4）。

PWL3的5类碱基序列所翻译氨基酸与已克隆的氨基酸序列比对结果见图5，PWL3-1在101位处出现移码突变导致后面氨基酸发生变化;PWL3-2在57位处发生突变导致后面均发生变化;PWL3-3在52位处发生移码变异导致后面氨基酸均发生变化;PWL3-4氨基酸在52位处发生移码突变，但在57位处发生同义突变，在101位处再次发生移码突变导致后面氨基酸均发生变化。

2.2.3 PWL4基因的序列分析

从241个扩增出目的条带的菌株中挑选涵盖所有地区的菌株20个送去测序。将测序得到的PWL4与已克隆的PWL4序列比对。结果显示，20个菌株的PWL4碱基序列可分为3种类型，且与已克隆的PWL4基因序列均有多处差异，其主要差异有42处，其中第一类与这42处差异相同，本试验命名为PWL4-1;第二类与PWL4-1相比除了42处共同差异外又增加了一处，即在54位处碱基G的缺失，本试验命名为PWL4-2;第三类与PWL4-2相比增加了一处变异，即在58位处碱基C的缺失，本试验命名为PWL4-3（图6）。

PWL4的3類碱基所翻译氨基酸与已克隆的氨基酸序列比对结果见图7，PWL4-1、PWL4-2和PWL4-3氨基酸序列均在18位处发生移码突变导致后面氨基酸发生变化。

2.3 PWL家族进化分析

黑龙江省稻瘟病菌PWL家族变异类型的系统发育树表明，15个基因型共分为2大支系，一个支系为PWL1、PWL2、PWL2-1、PWL2-2、PWL2-3、PWL2-4，其亲缘关系较近;另一个支系为PWL3、PWL3-1、PWL3-2、PWL3-3、PWL3-4、PWL4、PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3。其中PWL3与PWL4-1、PWL4-2、PWL4-3的亲缘关系要近于PWL4（图8）。

3 讨论

探索无毒基因在自然菌株群体中的分布，可以了解稻瘟病菌群体中菌株的组成及变异特点[18]。本研究通过对329个单孢菌株DNA进行PWL家族的PCR扩增，结果显示，PWL1在329个菌株中均未检测出目的条带，与穆慧敏等[15]研究结果一致，PWL1仅存在于牛筋草来源的稻瘟菌菌株中，而在分离于水稻的稻瘟病菌中表现为完全缺失;PWL2出现频率为73.86%，且在黑龙江省各稻区均有分布;PWL3出现频率相对较低，为40.73%;PWL4在黑龙江省各地区也都有分布，出现频率为73.25%。

病原菌无毒基因不稳定，常常引发变异，变异机制主要包括缺失、插入、点突变、复制、移码突变等[19]。据报道PWL家族旁侧序列的DNA重结合常导致PWL基因的异位、缺失、复制或倒位[6]。因此，PWL 家族的基因序列经常发生变异。穆慧敏等[15]采用12对特异性引物对来源于水稻的28株菌株检测到PWL2、PWL3和PWL4基因18种类型;余欢等[20]研究发现PWL2基因上游出现多位点现象，PWL3基因上游出现插入类型，PWL4基因上游和下游区域出现了部分缺失。本试验主要针对PWL家族基因的编码区进行PCR扩增与序列比对分析，结果发现，PWL2检测出5种基因型（2、2-1、2-2、2-3、2-4）;PWL3也检测出5种基因型（3、3-1、3-2、3-3、3-4）;PWL4检测到4种基因型（4、4-1、4-2、4-3）。研究结果表明PWL 家族基因编码区的主要变异类型为点突变，且变异位点丰富。但新变异类型能否影响无毒功能的丧失还需进行致病性的测定来验证。

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（责任编辑：田 喆）