新型蛇葡萄素衍生物γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯的合成、表征及抗肿瘤作用评价

吴晓珊 倪峰 高毓瀅 黄仁杰

摘 要 目的：设计合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并进行表征和体外抗肿瘤活性评价。方法：利用酯化反应将蛇葡萄素接载在γ-聚谷氨酸上生成合成产物。采用紫外光谱法、傅里叶红外光谱法、氢-1核磁共振法及元素分析等方法对合成产物的结构进行表征;采用紫外吸收光谱法在293 nm波长处测定合成产物中蛇葡萄素的含量。以5-氟尿嘧啶为阳性对照，采用MTT法检测γ-PGA-AMP、蛇葡萄素对人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549的抑制作用，计算半数抑制浓度（IC50）。结果：表征结果显示，蛇葡萄素的7位游离羟基与γ-聚谷氨酸a位碳上的羧基已发生了酯化反应，合成产物即为γ-PGA-AMP（产率为55.7%），其中蛇葡萄素含量为32.3%。γ-PGA-AMP和蛇葡萄素对MCF-7、HepG2和A549细胞均有明显的抑制作用;γ-PGA-AMP对上述3种肿瘤细胞的IC50分别为40.19、28.29、55.23 μg/mL，蛇葡萄素的IC50分别为105.30、81.23、130.10 μg/mL，5-FU的IC50分别为24.72、87.98、30.99 μg/mL。结论：成功合成具有体外抗肿瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗肿瘤活性强于蛇葡萄素。

关键词 蛇葡萄素;γ-聚谷氨酸;高分子化合物;合成;表征;抗肿瘤作用

中图分类号 R284.3;R979.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2020）22-2720-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.06

ABSTRACT   OBJECTIVE： To design and synthesize poly （γ-glutamic acid）-ampelopsin （γ-PGA-AMP）， and to characterize it and evaluate its anti-tumor activity in vitro. METHODS： Synthetic product was produced through an esterification reaction between γ-PGA and ampelopsin. The structure of synthetic product was characterized by the UV spectrophotometry， Fourier transform infrared （FT-IR） spectroscopy，1H-NMR spectra and the quantitative elemental analysis. The content of ampelopsin in synthetic product was determined by UV absorption spectrometry at 292 nm. Using 5-FU as positive control， MTT assay was used to determine inhibitory effects of γ-PGA-AMP and ampelopsin on human breast cancer cell MCF-7， human liver cancer cell HepG2 and human lung cancer cell A549. The IC50 was calculated. RESULTS： The results showed that the free 7-hydroxyl group of ampelopsin and the a-carboxyl group of γ-polyglutamic acid had been esterified to obtain γ-PGA-AMP; the yield of γ-PGA-AMP was 55.7%， and the content of ampelopsin was 32.3%. The inhibitory effect of γ-PGA-AMP and ampelopsin on MCF-7， HepG2 and A549 cells was obvious. IC50 of γ-PGA-AMP （to 3 above tumor cells） were 40.19， 28.29 and 55.23 μg/mL， those of ampelopsin were 105.30， 81.23， 130.10 μg/mL， those of 5-FU were 24.72， 87.98， 30.99 μg/mL， respectively. CONCLUSIONS： γ-PGA-AMP with anti-tumor effect in vitro is synthesized successfully， and its anti-tumor effect is stronger than that of ampelopsin.

KEYWORDS   Ampelopsin; Poly （γ-glutamic acid）; Polymer compounds; Synthesis; Characterization; Anti-tumor effect

蛇葡萄素的化學名为3，5，7，3′，4′，5′-六羟基-2，3-二氢黄酮，分子式为C15H12O8，又名二氢杨梅素、双氢杨梅树皮素、福建茶素等，是一种多酚羟基双氢黄酮醇，属黄酮类化合物[1-2]，主要存在于大叶蛇葡萄[3]、藤茶[4]等多种植物中。蛇葡萄素的毒性低，具有抗氧化、镇痛、止咳、抑菌、保肝护肝、改善肝纤维化、降血糖、降血脂、增强免疫力、抗肿瘤等多种药理活性[5-7]。目前，蛇葡萄素的研究热点在其抗肿瘤活性上，但是在研究过程中，有学者发现该化合物的体内抗癌效果并不理想，分析原因可能与该化合物溶解性和稳定性较差，同时存在较多的作用靶点，选择性不强、药理效应较弱等不足有关[8-9]。针对上述不足，本课题组拟选用高分子聚合物γ-聚谷氨酸对蛇葡萄素进行结构修饰。γ-聚谷氨酸是一种天然高分子聚合物，是由谷氨酸重复单元通过α-氨基与γ-羧基之间的酰胺键连接而成，是一种可生物降解、无毒、无免疫源性的药物载体[10-11]。γ-聚谷氨酸的分子链上具有活性较高的侧链羧基，易与一些抗癌药物形成高分子药物复合体，具有良好的药动学特性，能通过高渗透长滞留效应（Enhanced permeability and retention effect，EPR）使药物在肿瘤组织中积累[12]。可见，γ-聚谷氨酸是一类较理想的体内药用高分子材料。基于此，本课题组将蛇葡萄素连接在γ-聚谷氨酸的羧基端以合成γ-聚谷氨酸蛇葡萄素酯（γ-PGA-AMP），并对合成产物进行表征和抗肿瘤活性评价，旨在提高蛇葡萄素的抗肿瘤活性，并为符合临床需求抗肿瘤新药的研发提供参考，为肿瘤治疗提供新的选择。蛇葡萄素、γ-聚谷氨酸和γ-PGA-AMP的结构式见图1。

1 材料

1.1 仪器

FD-1C-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）;DF-101S型集热式磁力搅拌器（常州国华仪器有限公司）;1835型乌氏黏度计（毛细管内径：0.5 mm，上海隆拓仪器设备有限公司）;UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）;740SX型傅里叶红外光谱（FT-IR）仪（美国Nicolet公司）;Unity 500MHz型核磁共振（NMR）仪（美国Varian公司）;Vario ELⅢ型元素分析仪（德国Elementar公司）;HF212UV型CO2培养箱（香港力康生物医疗科技控股集团）;ELX800型酶标仪（美国BioTek公司）。

1.2 药品与试剂

蛇葡萄素原料药（张家界生力生物有限公司，批号：160726，纯度：>98.5%）;γ-聚谷氨酸原料药（分子量：约2×106 Da，南京轩凯生物科技有限公司，批号：20181004，纯度：>92%）;透析袋（透过分子量：8 000～14 000 Da，美国联合碳化物公司）;RPMI-1640培养基（批号：2016-12）、胎牛血清（批号：2017-09）、青-链霉素双抗（批号：2017-05）均购自美国Gibco公司;MTT试剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：20160922）;5?氟尿嘧啶原料药（5-FU，美国Selleck公司，批号：s1209，纯度：99.97%）;二环己基碳二亚胺（DCC，批号：20170314，化学纯）、4-二甲氨基吡啶（DMAP，批号：20160701，分析纯）、盐酸（批号：20161018，分析纯）、二甲基亚砜（DMSO，批号：20160610，分析纯）、乙醚（批号：20160518，分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司;G 25×75型硅胶G薄层层析制备板（粒径：100～200目，青岛海洋化工有限公司）;其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为去离子水。

1.3 细胞

人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549等细胞株均由福建医科大学药学院实验中心提供，其原代细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法与结果

2.1 小分子γ-聚谷氨酸的制备

参考文献方法[13]，首先，纯化大分子γ-聚谷氨酸原料药：取γ-聚谷氨酸原料药100 g，用水500 mL溶解，加入无水乙醇1 500 mL，静置得到γ-聚谷氨酸沉淀;取沉淀，用去离子水500 mL重新溶解、超滤，除去不溶物，再次加入无水乙醇1 500 mL沉淀后，对所得沉淀进行冷冻干燥，即得白色块状大分子γ-聚谷氨酸。其次，采用高温降解法降解大分子γ-聚谷氨酸：取上述大分子γ-聚谷氨酸10 g，用水配制成2%（下同）的水溶液，用盐酸调pH至2～3，高温高压（121 ℃、0.1 MPa）处理20 min后，立即冰浴冷却;用NaOH调pH至7～8，冷冻干燥，即得白色棉絮状小分子γ-聚谷氨酸钠盐。最后，制备小分子γ-聚谷氨酸：用水配制2%的小分子γ-聚谷氨酸钠盐水溶液，用盐酸调pH至2.0左右，用水透析48 h，冷冻干燥后，即得白色絮状小分子γ-聚谷氨酸。

2.2 γ-PGA-AMP的合成

取蛇葡萄素0.59 g（约1.8 mmol）溶于DMSO 20 mL中，于室温下搅拌溶解，加入DCC 0.37 g（约1.8 mmol）、DMAP 0.1 g（约0.82 mmol），再加入含有小分子γ-聚谷氨酸1.24 g（约9.37 mmol）的DMSO 180 mL，置于集热式磁力搅拌器中，于40 ℃下搅拌反应。利用蛇葡萄素与三氯化铁溶液反应显紫色，采用薄层色谱（TLC）监测酯化反应过程。反应进行24 h时，TLC显示原料蛇葡萄素点消失，停止反应。然后在反应液中加入10倍体积的无水乙醚，洗涤、振荡，4 ℃下静置过夜待溶液分为两层。收集下层淺黄色溶液，冷冻干燥后，即得黄色粉状合成产物γ-PGA-AMP 1.02 g，产率为55.7%。

2.3 表征

2.3.1 紫外光谱检测 取合成产物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料药各0.005 g，分别用DMSO 1 mL溶解，在200～800 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，结果见图2（γ-聚谷氨酸在此范围内无最大吸收，图略）。

由图2可见，γ-PGA-AMP苯环上的最大吸收峰位于293.66 nm波长处;与蛇葡萄素相比，苯环上最大吸收峰红移约2 nm。这可能是由于蛇葡萄素的7位羟基与聚谷氨酸a位碳上的羧基发生酯化反应，聚谷氨酸酯基团的吸电子能力略强于羟基基团，降低了分子内电子跃迁的能级差，使分子紫外吸收发生了红移[14-15]。另外，γ-PGA-AMP紫外光谱中200～270 nm波长范围内有多个γ-聚谷氨酸羧基双键的吸收峰。这可能与γ-聚谷氨酸结构中处于分子链末端和分子链内部的羰基基团的吸收波长略有差异有关。

2.3.2 FT-IR检测 取合成产物γ-PGA-AMP、蛇葡萄素原料药各适量，分别与少量KBr混匀后压片，于20～25 ℃下，使用FT-IR光谱仪检测400～4 000 cm-1波数范围内的FT-IR光谱，结果见图3（γ-聚谷氨酸在此范围内无最大吸收，图略）。

由合成产物γ-PGA-AMP的FT-IR光谱图（图3A）可见，酯键上的碳氧单键σC-O：1 090、1 249 cm-1;酯键的羰基σC=O：1 728 cm-1;羧酸的羰基σC=O：1 646 cm-1;亚甲基σC-H：2 921 cm-1;芳环σAr-H：955 cm-1，δAr-H：1 352、1 315 cm-1（σ：伸缩震动;δ：面内弯曲震动）。对比蛇葡萄素的FT-IR光谱图（图3B），3 630 cm-1处蛇葡萄素游离羟基的吸收峰已经消失，1 650 cm-1处的羰基吸收峰由于取代基团的改变位移至1 646 cm-1。这提示蛇葡萄素上的游离羟基与γ-聚谷氨酸上的羧基可能已发生了酯化反应。

综上所述，本研究成功合成了具有体外抗肿瘤活性的γ-PGA-AMP，且抗肿瘤活性强于蛇葡萄素，为抗肿瘤药物的开发提供了新思路。

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（收稿日期：2020-06-16 修回日期：2020-10-15）

（编辑：邹丽娟）