环状RNA及其在猪上的研究进展

闫尊强，姜天团，孙文阳，王鹏飞，黄晓宇，杨巧丽，胡慧艳，李守湖，滚双宝,

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，甘肃 兰州 730070；3.河北农业大学动物科学技术学院，河北 保定 071000；4.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070)

circRNA是一类新发现的不编码蛋白质的内源性RNA分子，是非编码RNA(如miRNA、lncRNA、piRNA)重要成员之一，广泛存在于自然界中的各种生物体内，如人[1]、猪[2]、小鼠[3]、秀丽隐杆线虫[4]、古细菌[5]等.研究发现circRNA与生物体正常发育、疾病的发生与发展等生物学过程密切相关，已成为生物学研究的热点[6-8].本文将从circRNA的发现、生成、分类、特征、功能及其在猪上的研究进展作一综述.

1 circRNA的发现

1976年Sanger等[9]使用电子显微镜研究植物类病毒(viroids)时，发现4种类病毒颗粒中均含有闭合的环状分子；1990年Matsumoto等[10]用电子显微镜在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中发现了无5’端和3’端且呈环形状的20S，该研究首次从真菌单细胞生物体中发现了circRNA的身影；1991年Nigro等[11]发现抑癌基因DCC可转录出4个circRNA，表达量较低，主要存在于细胞质中；1993年Capel等[12]使用寡核苷酸杂交技术及RNase H消化试验研究了小鼠睾丸中的Sry基因的转录产物，发现该转录产物是环状分子；1993年Cocquerelle等[13]发现人ets-1基因转录出的产物可稳定存在于细胞质中，且呈环形，表明ets-1基因可转录出circRNA；1996至1997年Zaphiropoulos等[14-15]发现鼠细胞色素P4502C24基因及人细胞色素P-4502C1基因均可生成circRNA；2010年Burd等[16]用RACE(rapid amplification of cDNA ends)和RNase R消化试验研究了人ANRIL基因的转录产物，发现其中一产物呈环状，即circular ANRIL(cANRIL).尽管在生物体中已经发现了circRNA的影子，但由于circRNA表达丰度不高，及当时检测技术水平的限制，一直认为circRNA是由外显子转录而形成的异常产物，未引起科学家的关注.

近年来，随着RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)技术的快速发展以及生物信息学方法的不断完善，科学家们已鉴定出了大量的circRNA.2011年Danan等[5]使用RNA-Seq技术发现古细菌硫化叶菌P2(archaeon sulfolobus solfataricus P2)存在多个circRNA，并认为这些circRNA对古细菌的正常生命活动起重要作用；2012年Salzman等[17]对CD19+白细胞、CD34+白细胞及中性粒白细胞(neutrophils)进行RNA-Seq测序，发现人体细胞中普遍存在circRNA，从此circRNA才算正式进入了科学家的视野；2015年Abdelmohsen等[18]用RNA-Seq技术探究了恒河猴骨骼肌中的circRNA，共发现了12 007个circRNA，这些circRNA可能对肌肉的生长发育有重要影响；2015年Li等[19]使用RNA-Seq技术对肝脏MHCC-LM3癌细胞及其外泌体进行了circRNA的挖掘，在细胞及外泌体中分别发现了5 484个和6 751个circRNA，表明circRNA参与肝脏癌症的发生发展过程，外泌体中的circRNA可能为肝癌的诊断标志物；2019年Liu等[20]对不同发育阶段的斑马鱼胚胎进行了circRNA研究，从受精后4.5、8、24、48、72 h的胚胎中共发现了1 029个circRNA，该研究证实了circRNA对斑马鱼的正常发育起至关重要的作用.总之，各个学科领域中诸多circRNA的发现归功于更新迭代的高通量测序技术和生物信息学方法.

2 circRNA的生成及分类

真核生物中普遍存在一种剪接方式，能通过共价键连接多个外显子或内含子的5’端和3’端，从而形成具有环状结构的RNA分子，此种剪接方式被称为反向剪接[21-22].目前，circRNA的形成有外显子环化和内含子环化两种途径[23].套索驱动环化(lariat-driven circularization)及内含子配对环化(intron-pairing driven circularization)是外显子环化的2种形式，套索驱动环化指在转录的过程中核不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)可折叠拉近非相邻的外显子，出现外显子跳跃(exon skipping)，并产生套索中间体，套索中间体剪接后形成外显子circRNA，而内含子配对环化是指侧翼内含子通过碱基互补配对产生环状结构，最后剪接掉环状结构中的内含子，保留的外显子即可环化形成外显子circRNA；一般情况下，由内含子组成的套索结构会被脱分支酶降解[24]，但在人胚胎干细胞及Hela细胞中找到了能避免被脱分支酶降解的内含子套索结构，这些内含子5′端剪接点包含7个富集GU的基序及3′端分支点含有的11个富集C的基序，独特的核苷酸序列可保护其在剪接之后免受脱分支酶的降解进而加工产生只包含内含子的circRNA[25].研究发现两个以上的外显子在环化过程中，外显子之间的内含子很可能滞留其中，从而加工形成含有外显子和内含子的circRNA[26].

因此，外显子环化和内含子环化可产生分别由外显子、内含子以及外显子和内含子共同组成的3种不同类型的circRNA，即外显子型circRNA(exonic circRNA,EciRNA)、内含子型circRNA(intronic circRNA,IciRNA)和外显子-内含子型circRNA(exon-intron circRNA,EIciRNA)，这3种类型的circRNA的基本信息详见表1.

表1 三种类型circRNA的基本信息

3 circRNA的特征

相比较于线性非编码RNA，circRNA有以下特征[27-29]：

1)无5′端帽子结构和3′端poly(A)尾巴，5′端和3′端序列紧密相连，形成了内源性非编码RNA；

2)大部分由外显子构成的circRNA序列保守性强，进化保守，然而部分内含子构成的circRNA序列保守性较差；

3)circRNA是共价键形成的环形结构，不易被核酸酶降解，更加稳定；

4)circRNA具有明显的细胞和组织特异性以及阶段特异性，还有种属特异性，即有些circRNA只存在于人中，而其他物种(如猪、牛)中没有；

5)大多数circRNA在生物体内的表达量比较低.

4 circRNA的功能

4.1 circRNA可作为miRNA海绵

miRNA是一类长度为18～24 nt，且无蛋白编码潜能的内源性单链RNA，miRNA能够通过碱基互补配对与蛋白编码基因转录产物mRNA结合，从而调控靶基因的表达[30].研究发现位于细胞浆的circRNA上有miRNA结合位点(binding sites)，circRNA可作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)来吸附miRNA，进而抑制miRNA活性，致使靶基因表达量升高[31].退行性相关蛋白基因1(cerebellar degeneration related 1,CDR1)转录出的ciRS-7存在于人和小鼠的大脑，ciRS-7含有70个miRNA-7的结合靶点，发现单个细胞中的所有ciRS-7分子可结合20 000个左右的miRNA-7分子，ciRS-7作为miRNA-7的海绵影响miRNA-7靶基因CDR1的表达，过表达ciRS-7可导致斑马鱼大脑发育受阻，脑体积变小，表明ciRS-7吸附miRNA-7参与动物大脑的正常发育过程[32]；由小鼠睾丸性别决定基因Sry产生的circSRY，特异性地表达于睾丸组织，其至少包含16个miRNA-138的结合靶点，因此circSRY可作为miRNA-138海绵体调控Sry基因参与睾丸发育过程[12,32]；在人宫颈癌中高表达的hsa_circRNA_101996可充当miRNA-8075的海绵来促进TPX2基因的表达，进而促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭，说明hsa_circRNA_101996有促进宫颈癌的作用[33].

4.2 circRNA调控基因转录

诸多研究表明，位于细胞核的circRNA可以调控其母基因的转录进而影响母基因的表达.人体细胞ankrd52基因序列中存在内含子环化依赖的motif，该基因可转录出一个circRNA，即ci-ankrd52，能够与RNA聚合酶II结合，进而促进ankrd52基因的转录[25-26]；由EIF3J(eukaryotic translation initiation factor 3J)基因转录出的circRNA，即EIciEIF3J，与U1小核核糖核蛋白(U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP)结合，然后EIciEIF3J-U1 snRNP复合体转移并结合到EIF3J基因的启动子区域，从而激活EIF3J基因的转录[26,34].

4.3 circRNA作为翻译模板

circRNA作为哺乳动物基因组中一类转录本，已有报道发现一些circRNA可作为翻译模板并生成执行生物学功能的蛋白质.Zhang等[35]发现P53诱导转录长链非编码RNA(LINC-PINT)的第二外显子可形成circRNA(circPINTexon2)，分析circPINTexon2所有可能的开放阅读框，推测circPINTexon2有2个sORFs具有潜在编码67aa和87aa的肽，试验结果证实只有87aa肽能够正常表达，还发现在RNA circ-PINT以及翻译的87aa蛋白在癌症(如乳腺癌、肝癌)中低表达，而在正常组织中高表达.裸鼠体内成瘤试验也表明，PINT87aa高表达时成瘤能力减弱，动物的生存期延长，说明该circ-PINT编码的肽产物可能在恶性肿瘤的治疗、诊断、预后方面发挥重要调控功能；Yang等[36]发现著名的抑癌基因FBXW7的第3及第4外显子环化后可形成一个620 nt的circRNA，即circ-FBXW7，该circRNA序列中存在内部核糖体插入位点序列(internal ribozyme entry site，IRES)，推测可能具有编码蛋白质的潜能，双荧光素酶试验发现其可编码185个氨基酸，这些氨基酸形成的蛋白质的分子量约为21 ku，circ-FBXW7产生的蛋白质具有抑制胶质瘤的作用，可能会作为胶质瘤患者的临床预后的一个分子标记物；Zhang等[37]对神经胶质瘤组织和邻近正常组织进行了circRNA-Seq，有5 498个circRNA存在显著差异(FDR ≤ 0.01，fold-change ≥ 2)，其中circ-SHPRH长度为440 nt，该序列包含IRES元件，进一步使用分子克隆、质谱等试验发现，circ-SHPRH可翻译出一个包含146个氨基酸的17 ku多肽产物，此外研究还发现circ-SHPRH序列中的ORF是跨过接口后形成终止密码子的，终止密码子和起始密码子同时用了一个A碱基，circ-SHPRH生成的蛋白质具有抑制胶质瘤的作用，高表达circ-SHPRH蛋白产物的病人预后较好.

5 circRNA在猪上的研究进展

5.1 在大脑上的研究进展

2015年Veno等[38]采集第23天、第42天、第60天、第80天、第100天、第115天的猪胎儿脑组织，包括基底核(basal ganglia)、脑干(brain stem)、小脑(cerebellum)、皮质(cortex)和海马(hippocampus))样本进行去核糖体RNA的cDNA文库构建，然后用高通量测序技术挖掘出了4 634个circRNA，大部分circRNA在第60天胎儿猪皮质组织中有很高的丰度，呈现出明显的差异表达趋势，相比较于第80天、第60天胎儿猪皮质组织中差异高表达circRNA的母基因(host gene)富集的前3名信号通路为Wnt、Axon guidance和TGF-beta，已证实这3条信号通路与神经分化、神经细胞迁移有关，说明这些差异表达circRNA在猪胚胎大脑发育的生物学过程中发挥着重要调控功能；Chen[39]研究了180日龄和8岁‘Yana猪’的大脑皮质，共发现了9 541个circRNA，180日龄和8岁‘Yana猪’大脑皮质共享2 091个circRNA，180日龄猪大脑皮质特异circRNA有1 793个，而8岁猪大脑皮质特异circRNA有5 657个，有148个差异表达circRNA(包括133个上调表达和15个下调表达)，发现了一些与猪大脑皮质衰老密切相关的circRNA，如circRNA019168、circRNA008099、circRNA009918，表明circRNA参与猪大脑皮质老化过程.

5.2 在肌肉上的研究进展

2014年马继登等[40]使用高通量测序技术从猪腰大肌和背最长肌中发现了56个circRNA，这些circRNA转录本长度分布不均，最长的为3 9645 nt，最短的是105 nt，48.12%的circRNA长度在6 000 nt以内，此外，42个circRNA均有超过50个miRNA靶点，表明鉴定出的circRNA可能通过吸附miRNA参与调控猪肌肉的发育过程；2017年Sun等[41]在‘长白猪’和‘蓝塘猪’背最长肌中分别鉴定到了3 826个、2 300个circRNA，共享的circRNA有916个，差异表达circRNA有4 360个，包括1 401个上调表达和2 959个下调表达，其中236个差异表达circRNA有93个与肌肉发育相关的基因编码，表明circRNA参与调控肌肉发育过程，且对不同类型的猪肉品质有影响；Chen等[42]研究了180日龄和8岁‘Yana猪’的心肌和骨骼肌，心肌和骨骼肌中分别发现了7 090及4 402个circRNA，180日龄与8岁‘Yana猪’心肌相比，有26个差异表达circRNA，180日龄与8岁‘Yana猪’骨骼肌相比，有62个差异表达circRNA，发现了一些与猪心肌和骨骼肌衰老密切相关的circRNA，如circRNA010618、circRNA005698、circRNA010340、circRNA003476，表明circRNA参与猪心肌和骨骼肌老化过程；Wang等[2]利用RNA-Seq方法研究了瘦肉型猪(杜长大)和脂肪型猪(Huainan)背最长肌中的circRNA，共检测出了6 988个circRNA，其中有66个差异表达(32个上调表达和34个下调表达)，差异表达的circRNA主要富集在与骨骼肌发育及生长有关的GO功能和KEGG信号通路，如快慢肌转化、细胞迁移等GO功能及Wnt等KEGG信号通路，表明circRNA参与猪背最长肌的生长.

5.3 在肝脏上的研究进展

Huang等[43]采集70日龄‘长白猪’和‘金华猪’肝脏组织进行了转录组测序，2种猪肝脏中共挖掘到了84 864个circRNA，共表达的circRNA有42 041个，差异表达circRNA有366个(包括116个上调和250个下调)，这些差异表达circRNA主要富集在与脂肪代谢相关中信号通路上，表明circRNA调控了猪只的脂肪代谢；Chen等[44]研究了180日龄和8岁‘Yana猪’的肝脏，共发现了6 366个circRNA，180日龄和8岁‘Yana猪’肝脏共享1 074个circRNA，180日龄猪肝脏特异有circRNA有845个，而8岁猪肝脏特异circRNA有4 447个，发现了一些与猪肝脏衰老密切相关的circRNA，如circRNA020421、circRNA017214、circRNA006616，表明circRNA参与猪肝脏老化过程.

5.4 在脂肪上的研究进展

2019年Liu等[45]研究了‘二花脸猪’背最长肌内脂肪(IAT)、背皮下脂肪(SAT)、腹膜脂肪(RPAT)和肠系膜脂肪(MAT)组织中的circRNA，4种不同部位的脂肪中共发现了13 746个circRNA，特异性表达的circRNA分别有3 386个、1 123个、1 332个和2 466个，差异表达circRNA共有3 176个，其中IAT与SAT有1 367个、IAT与RPAT有1 007、个、SAT与RPAT有999个、MAT与IAT有1 153个、MAT与SAT有1 256个、MAT与RPAT有837个，筛选出了一批与脂肪沉积及脂质代谢有关的circRNA，如SAT中高表达的circ_0004917与circ_0007488、IAT中低表达的circ_0010483及高表达的circ_0007945，表明circRNA参与猪的脂肪沉积及脂质代谢过程；李嫒等[46]使用高通量测序技术从180日龄‘大白猪’和‘莱芜猪’背最长肌内脂肪组织中发现了9 649个circRNA，差异表达circRNA有181个，包括上调表达102个和下调表达79个，这些差异表达circRNA富集的GO功能有胆固醇平衡、脂质代谢平衡、甘油酯平衡等，富集的KEGG信号通路有过氧化物酶体、脂肪酸降解、不饱和脂肪酸的生物合成等，还鉴定出了参与脂肪沉积有关的2个circRNA，即ssc_circ_0002807和ssc_circ_0009352，该研究表明鉴定出的circRNA可能参与调控脂质沉积和脂质代谢；2018年Liu等[47]对‘Erhualian猪’的不同分化时间点(0、2、4和8 d)皮下前体脂肪细胞进行了circRNA分析，共鉴定出了8 623个circRNA，第2天与第0天、第4天与第2天、第8天与第4天、第4天与第0天和第8天与第0天各有902、787、710、932、850个差异表达circRNA，此外，发现了与皮下脂肪细胞分化最密切相关的297个差异表达circRNA，这些circRNA富集的GO功能有脂质代谢调控、脂肪酸代谢过程等，该研究表明circRNA对猪皮下脂肪细胞分化及脂肪生成的生物学过程；2018年Li等[48]利用RNA-Seq技术研究了‘大白猪’和‘莱芜猪’皮下脂肪组织中的circRNA，共检测出了29 763个circRNA，其中275个差异表达(70个上调表达和205个下调表达)，差异表达的circRNA主要富集在了与脂肪沉积、脂质代谢有关的GO功能和信号通路，如脂质储存的负调控、甘油三酯代谢、脂肪酸代谢、脂肪酸合成等GO功能及PPAR、TGF-β、MAPK等信号通路，并筛选出了两个与脂肪沉积及脂质代谢最密切相关的circRNA(circRNA_26852和circRNA_11897)，表明circRNA对猪的脂肪沉积及脂质代谢有潜在影响，可用于猪的遗传育种；左小元等[49]对‘长白猪’的脂肪干细胞(pADSCs)及诱导形成的完全重编程细胞(piPSCs)中的circRNA进行了解析，共鉴定到了27 005个circRNA，piPSCs和pADSCs共表达的circRNA有6 983个，特异性表达的circRNA有13 138个、6 884个，其中差异表达的circRNA有243个，包括上调表达的155个和下调表达的88个，差异表达circRNA共富集了137个KEGG信号通路，其中显著富集的有22个，如MAPK、p53，这些通路与细胞多能性密切相关，说明差异表达circRNA可能参与了诱导猪脂肪干细胞形成猪完全重编程细胞这一生物学过程.

5.5 在生殖器官上的研究进展

2017年Ran等[50]对30和180日龄‘沙子岭猪’的睾丸组织进行了测序，在未成熟和成熟睾丸中共鉴定出了14 108个circRNA，未成熟和成熟睾丸中共表达的circRNA有3 220个，特异性表达的circRNA有2 819和8 069个，差异表达circRNA有12 274个(包括3 510个上调和8 764个下调)，这些差异表达circRNA主要富集在与睾丸发育、精子形成的信号通路上，如MAPK、Wnt、PI3K-Akt、Hedgehog信号通路，表明circRNA在睾丸成熟过程中发挥着重要功能；2019年谢苏等[51-52]使用RNA-Seq技术对卵泡中的circRNA进行了研究，发现circ0001651在‘杜洛克猪’M2卵泡中的表达量极显著低于‘梅山猪’，在‘梅山猪’M1卵泡中的表达量极显著低于‘杜洛克猪’，circ0001651的潜在靶基因CCR2、EGFL7、TNFRSF12A等与猪的卵泡发育过程相关，此外还发现circ0015292在杜洛克猪S卵泡中的表达量极显著低于‘梅山猪’，在‘梅山猪’M1、M2、L卵泡中的表达量均显著低于杜洛克猪，circ0015292的潜在靶基因GADD45G、IL20RB、CFL1、LAMB3等与猪的卵泡发育过程相关，说明circ0001651和circ0015292可能调控靶基因间接参与卵泡发育过程，该研究为探究猪繁殖的分子机理提供了新视角；Hu等[53]采用RNA-Seq技术，分别对黄体期和卵泡期的高产仔数和低产仔数大白母猪卵巢组织circRNA进行了研究，共发现了21 386个circRNA，黄体期高产和低产组之间有1 079个差异表达circRNA(458个上调，621个下调)，卵泡期鉴定到1 077个差异表达circRNA(347上调和730个下调)，2个对比组间获得了91个共有的差异表达circRNA，这些差异表达circRNA的母系基因大多显著富集到与繁殖相关信号通路中，其中在黄体期主要富集到类固醇生物合成、FOXO、甲状腺激素信号通路，而在卵泡期则主要富集到TGF-β、细胞周期和Wnt等信号通路，该研究发现circRNA参与调控了猪繁殖过程.

5.6 在猪感染性疾病上的研究进展

2018年Yan等[54]研究了C型产气荚膜梭菌感染仔猪的脾脏组织中的circRNA表达谱，感染组和对照组共鉴定到了825个，其中有103个差异表达(50个上调表达和53个下调表达)，差异表达的circRNA主要富集在与免疫应答、炎症反应有关的KEGG信号通路，如TNF、B细胞受体、NF-κB、凋亡、Toll-like受体信号通路，发现了与仔猪感染C型产气荚膜梭菌密切相关的8个circRNA，包括circ_0002220、circ_0000821和circ_0002287，表明circRNA通过调节与免疫相关的信号通路进而影响仔猪感染C型产气荚膜梭菌；2019年Chen等[55]研究了猪流行性腹泻病毒感染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)后circRNA表达谱，感染组和对照组共鉴定到了26 670个，36 h感染组与对照组相比，存在152个上调表达和158个下调表达circRNA，60 h感染组与对照组相比，存在191个上调表达和226个下调表达circRNA，72 h感染组与对照组相比，存在152个上调表达和199个下调表达circRNA，这些差异表达circRNA富集的GO功能主要有转运活性、催化活性等，富集的KEGG信号通路有T细胞受体、MAPK等，表明circRNA可能通过调节与免疫相关的生物过程、信号通路进而影响猪流行性腹泻病毒在IPEC-J2中的复制，本研究为探索circRNA在猪流行性腹泻病毒感染机制中的作用提供了参考；2018年Ma等[56]对感染及未感染猪传染性胃肠炎病毒的IPEC-J2细胞的circRNA进行了研究，差异表达circRNA有123个，包括上调表达69个和下调表达54个，富集的KEGG信号通路主要有RIG-I-like receptor，TNF，NOD-like receptor和NF-κB等，挖掘出了一个与猪传染性胃肠炎病毒感染IPEC-J2关键circRNA，即ssc_circ_000380，发现ssc_circ_009380分子参与猪传染性胃肠炎病毒激活NF-κB信号通路的过程.

5.7 在猪circRNA数据库上的研究进展

2017年Liang等[57]使用转录组测序技术对240日龄贵州小型猪的9种器官(包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、睾丸、背最长肌和脂肪)及2个不同发育阶段(0和30日龄)的背最长肌进行了研究，共发现了5 934个circRNA，在240日龄猪只9种器官中均表达的circRNA有37个，这9个器官中特异性表达的circRNA有205、53、0、130、99、94、1 155、174和147个，0、30和240日龄背最长肌中共表达的circRNA有126个，说明circRNA对仔猪各器官的正常发育起至关重要的作用，该研究首次构建了猪不同器官的circRNA数据库(http://lnc.rnanet.org/circ/)，该数据库的建立极大地方便了人类深入探究猪器官发育的生物学过程.

6 展望

circRNA作为一类新发现的分子，诸多学者对其形成机制、功能等做了大量研究，取得了一系列研究成果，但有关猪circRNA的研究较少，仅对不同生长发育阶段、不同品种等猪组织及器官(如肌肉、脂肪、肝脏)进行了高通量测序，挖掘出了一些与猪经济性状(如肌肉发育、脂肪沉积)密切相关的circRNA，具有广阔的应用前景.由于此方面的研究时间短，还需要继续完善猪的基因组，提高猪的转录组数据分析水平及采用试验手段找到和鉴定更多的circRNA，并探究其发挥功能的分子机制.此外，如何将这些高通量测序数据整合成可供查阅及分析的综合数据库是一件急需开展的事情.因此，继续开展猪重要经济性状相关circRNA的功能和调控机制研究对猪的遗传改良具有重要的参考意义.