外周血Treg细胞与IDO检测对慢性乙型肝炎病毒感染者罹患原发性肝癌的预测价值

蔡溪巍，孙世忠，王秋野，王沈峰

(1.辽宁省金秋医院检验科，沈阳 110016； 2.辽宁中医药大学附属第二医院检验科，沈阳 110034)

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)是临床常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度极高，为癌症致死的主要原因之一，且乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染为PLC的首要致病因素。流行病学研究显示，HBV感染的患者最终发展为肝癌的风险是未感染者的5～10倍[1-2]。临床研究证实，随着HBV感染治疗手段的不断提高，PLC的发生风险虽得到了显著抑制，但尚不能完全消除，PLC治疗手段的提高虽然改善了患者的生命质量，但5年生存率并未明显提高[3]。因此，早期筛查并诊断PLC仍是最有可能延长患者生存时间的有效手段。然而，目前常用的血清甲胎蛋白、腹部超声检测等筛查手段准确率及敏感性并不理想，探寻新的PLC预测方法迫在眉睫。研究发现，抗肿瘤免疫应答缺陷是HBV感染患者发展为肝癌的主要作用机制之一，且具有免疫调节功能的调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)、吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)可能与肿瘤免疫逃逸密切相关，参与恶性肿瘤的发生及发展[4-5]。王星月等[6]的研究显示，PLC患者Treg细胞、IDO水平均较HBV感染者及健康人群明显升高；程源[7]的研究显示，Treg细胞、IDO与HBV感染发展为肝癌密切相关。但有关Treg细胞与IDO检测对慢性HBV感染者罹患PLC预测价值的报道较少。本研究旨在分析外周血Treg细胞与IDO检测对慢性HBV感染者罹患PLC的预测价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2019年12月辽宁省金秋医院收治的188例慢性HBV感染者作为研究对象，其中84例单纯慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者作为CHB组，104例合并PLC患者作为PLC组，选取同期60名健康体检者作为对照组。其中，CHB组男45例、女39例，年龄27～67岁，平均(42±15)岁；PLC组男59例、女45例，年龄22～74岁，平均(43±15)岁；对照组男33名、女27名，年龄26～71岁，平均(43±15)岁。三组受试者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经辽宁省金秋医院医学伦理委员会批准，受试者均签署了知情同意书。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：①CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[8]中CHB的诊断标准，乙型肝炎表面抗原和(或)HBV DNA阳性，且持续时间在6个月以上，伴有肝功能异常及丙氨酸转氨酶>38 IU/L；②PLC患者符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》[9]中PLC的诊断标准，乙型肝炎表面抗原阳性且甲胎蛋白≥400 μg/L；③年龄18～75岁。排除标准：①合并心、肺、肾等重要脏器功能障碍；②合并恶性肿瘤、脂肪肝、卵巢囊肿等可影响本研究结果的疾病；③合并药物性肝炎、酒精性肝病、其他类型病毒性肝炎、自身免疫性肝病；④处于月经期、妊娠期或哺乳期女性。

1.3主要试剂与仪器 鼠抗人单克隆抗体CD4-CP(批号：P0116057)、CD25-PE(批号：P0140484)、CD127-FITC(批号：P011537)购自北京灵宝科技有限公司生产；流式细胞仪(型号：EPICS XL)由美国Beckman Instruments公司生产；高速离心机(型号：Allegra 21R)由美国Beckman公司生产；Trizol试剂(批号：17694-031)、反转录试剂盒(批号：RR047A)、实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒(批号：RR420A)购自日本TaKaRa公司；引物设计及合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生产。

1.4检测方法

1.4.1Treg细胞 抽取各组受试者晨起空腹静脉血3 mL，在100 μL抗凝全血中加入5 μL鼠抗人单克隆抗体(CD4-CP、CD25-PE、CD127-FITC)混匀，室温下避光孵育15 min；加入1 mL溶血素混匀，室温下避光作用12 min；以离心半径15 cm、1 500 r/min离心5 min，弃上清后，加入2 mL磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)；离心半径15 cm、1 500 r/min离心5 min，弃上清后，再次加入300 μL PBS重悬细胞；采用流式细胞仪检测Treg细胞水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，并用Flowjo软件分析处理。

1.4.2IDO 信使RNA(messenger RNA，mRNA) 抽取各组受试者晨起空腹静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管内，加入淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque)22 ℃、离心半径10 cm、3 300 r/min密度梯度离心20 min，获取外周血单个核细胞；离心半径15 cm、1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤后，加入Trizol至细胞全部裂解后静置5 min，加入Trizol及氯仿作用5 min；4 ℃、离心半径10 cm、12 000 r/min离心15 min，取上层mRNA，加入Trizol及异丙醇作用10 min；4 ℃、离心半径10 cm、12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入75%乙醇洗涤；4 ℃、离心半径10 cm、9 000 r/min离心10 min，弃上清，吹干；加入二乙基焦碳酸酯水溶解、重悬后，60 ℃作用10 min，获取总mRNA(A260/A280值为1.8～2.0视为mRNA提取合格)；按照实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒说明书反转录合成互补DNA，内参采用β-Actin，结果使用公式F=2-△△Ct转换，IDO引物序列：上游5′-TTAATGTAACCCAACAAGAG-3′，下游5′-GTATTAGTTTGTGGCTCTGT-3′；β-Actin引物序列：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3′。

2 结 果

2.1三组受试者外周血Treg细胞及IDO mRNA水平比较 三组受试者外周血Treg细胞及IDO mRNA水平

比较差异有统计学意义(P<0.01)，CHB组和PLC组外周血Treg细胞及IDO mRNA水平均显著高于对照组，且PLC组高于CHB组(P<0.05)，见表1、图1。

表1 三组受试者外周血Treg细胞及IDO mRNA水平比较

2.2外周血Treg细胞及IDO mRNA水平与HBV感染严重程度的相关性分析 Spearman相关分析结果显示，外周血Treg细胞及IDO mRNA水平与HBV感染严重程度呈正相关(r=0.397、r=0.425，均P<0.001)。

2.3外周血Treg细胞及IDO mRNA在CHB患者罹患PLC中的预测价值分析 外周血Treg细胞预测CHB患者罹患PLC的AUC为0.815(95%CI0.703～0.928)，临界值为9.31%时，灵敏度为86.5%，特异度为72.2%；外周血IDO mRNA预测CHB患者罹患PLC的AUC为0.818(95%CI0.703～0.934)，临界值为2.38时，灵敏度为87.4%，特异度为71.3%。见图2。

3 讨 论

HBV感染是我国主要的病毒感染类型，据不完全统计显示，我国HBV携带者约1.2亿[10]。临床研究证实，HBV感染是引发PLC的独立危险因素，患者感染HBV后易逐渐发展为PLC，且大部分PLC患者发现时已进展为中晚期[11]。因此，寻找一种较为理想的PLC早期筛查方法，对改善患者预后、延长患者生存期具有重要意义。近年来有研究提出，抗肿瘤免疫应答缺陷与HBV感染患者发展为肝癌的主要作用机制密切相关，且证实Treg细胞具有免疫抑制与免疫无能两种免疫特性，可抑制自身T淋巴细胞的增殖，参与自身肿瘤细胞的免疫逃逸[12]；具有免疫调节功能的IDO可通过抑制自然杀伤细胞及T细胞活性而阻断免疫反应过程，以利于恶性肿瘤组织细胞的分裂、增殖[13-14]。杨峻等[15]通过观察HBV感染肝癌患者外周血Treg细胞和IDO的表达发现，PLC患者的Treg细胞、IDO均呈高表达。

CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原发性肝癌；Treg：调节性T细胞图1 对照组(1a)、CHB组(1b)、PLC组(1c)外周血Treg细胞流式图

Treg：调节性T细胞；IDO：吲哚胺2，3-双加氧酶；CHB：慢性乙型肝炎；PLC：原发性肝癌；ROC：受试者工作特征曲线图2 外周血Treg及IDO预测CHB罹患PLC的ROC曲线

肝癌在发生发展过程中可逃避机体免疫监视，致使肿瘤细胞免于被宿主的自身免疫系统清除。Treg细胞为特殊的T细胞亚群，可调控自身免疫反应，参与机体对感染性疾病、肿瘤等免疫耐受过程，不仅可分泌转化生长因子-β、白细胞介素-10、白细胞介素-12等细胞因子，进而抑制效应细胞的抗肿瘤免疫功能，还可以半乳糖凝集素为媒介与T细胞表面的糖蛋白受体发生反应而抑制T细胞分泌γ干扰素[16-17]。IDO为色氨酸-犬尿氨酸代谢途径中的限速酶，表达于具有调节免疫反应的细胞质内，在机体免疫抑制中具有重要调节功能，可通过分解代谢色氨酸而抑制T细胞的免疫功能。IDO水平升高可导致细胞微环境中的色氨酸消耗量增大直至耗竭，致使机体处于色氨酸饥饿状态，尤其是对病原微生物、迅速分裂期细胞中的色氨酸剥脱效应明显[18]。而当色氨酸浓度较低时，T细胞分化静止在G1期，其增殖被抑制，处于静息状态的T细胞较正常T细胞更易凋亡造成T细胞缺乏，进而使机体形成免疫豁免区，使肿瘤细胞免遭机体免疫系统的攻击[19]。部分学者认为，IDO水平升高导致局部微环境色氨酸耗竭而引发的T细胞强效免疫抑制可能是肝癌发生发展过程中形成免疫耐受，肝癌细胞逃避机体免疫攻击的关键[20-21]。本研究结果显示，CHB组和PLC组的外周血Treg细胞及IDO mRNA水平均显著高于对照组，且PLC组高于CHB组(P<0.05)，说明HBV感染早期病毒可通过上调IDO水平而抑制机体免疫反应，协助病毒在机体内持续存在，并形成恶性循环，最终利于PLC细胞的免疫逃逸，促使其向PLC发生发展。HBV感染后，机体启动细胞免疫抵御病毒感染，如T淋巴细胞可启动非溶细胞或溶细胞机制清除病毒控制感染。然而，一旦感染者对HBV的细胞免疫应答反应不足，即会表现为免疫耐受，致使机体免疫功能降低[22]。本研究通过ROC曲线分析显示，外周血Treg细胞及IDO mRNA预测慢性HBV感染者罹患PLC的灵敏度分别为86.5%、87.4%，特异度分别为72.2%、71.3%，与苗海霞等[23]的研究结果基本一致。

综上所述，外周血Treg细胞、IDO mRNA检测在预测慢性HBV感染者罹患PLC中具有较高的灵敏度及特异度，应用价值较高。通过生物医学手段下调慢性HBV感染者体内的Treg细胞及IDO水平，可能重建患者的主动免疫功能，从而抑制肿瘤的发生及发展。