基因编辑猪在农业与生物医学中的应用

戴伟龙 李荣阳 刘红林

（南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095）

猪是生物医学中常用的疾病模型动物，也是肉类工业的重要动物物种。同人生理和遗传学的相似性使猪成为疾病模型的理想模型。例如，X连锁原发性免疫缺陷的征状在猪身上比在小鼠身上能够更好的重现，将白细胞介素2受体亚基γ（ILRG2）破坏后，人和猪的T细胞检测均呈阴性，B细胞阳性，自然杀伤细胞阴性。猪肉也是肉类蛋白质的重要来源。根据美国农业部的报告，在2017年中猪提供了超过90亿kg的肉。随着收入的增高和城市化的发展，人们的生活水平会逐渐上升，预计肉类消费量将明显提高。然而，目前的肉类生产水平难以满足人们不断增长的需求。

通过基因工程的方法进行遗传改良，既可以生产出应用于生物医学的猪模型，也能提高肉用猪的生产力。遗憾的是，基因工程运用在猪身上的效率一直不高，因此限制了基因编辑猪在各个领域的应用。例如，第一个携带基因定向修饰的基因编辑猪的报道，比第一个基因敲除小鼠晚了10多年才出现，而且基因编辑猪仅在少数几个领域出现。近年来，随着基因组编辑技术的发展，基因工程的效率得到了明显的提高，逐渐改变了基因编辑猪的生产和使用模式。因此，可用于生物医学和农业的猪模型数量急剧增加。本文，我们总结了基因组编辑系统是如何在猪身上开发和使用的，并讨论其潜在的影响。

1 猪的传统基因工程

与小鼠不同，目前还没有建立猪多能干细胞系，导致制备携带定向修饰的基因编辑猪难度很大，从而阻碍了猪的基因研究和使用。为了建立可用于基因编辑猪生产的多能干细胞系，科学家们做了大量的研究，然而鲜有成功[7]。通过体细胞核转移技术（SCNT），第一个克隆哺乳动物多莉羊的诞生，开启了一条不必使用多能干细胞，生产基因编辑猪的新途径。概况来说就是利用内源性同源重组机制将定向修饰基因导入体细胞的基因组中，这些经过基因修饰的体细胞被用作SCNT的供体，以生产基因编辑动物。这种方法的可行性首先在绵羊身上得到验证，并迅速扩展到包括猪在内的非啮齿类动物。第一次克隆猪的报道出现之后，这种方法被用来生产第一批基因敲除猪。这些基因敲除猪缺乏编码α-（1，3）-半乳糖基转移酶的糖蛋白α-半乳糖基转移酶1（GGTA1），该基因合成半乳糖-α-（1，3）-半乳糖（α-Gal），主要功能是在异种移植后引起超急性排斥。GGTA1修饰猪为利用猪模型向异种移植的应用奠定了基础。

第一批基因敲除猪的出现引起了更多猪模型在生物医学领域的应用。例如，缺乏功能性囊性纤维化跨膜传导调节（CFTR）基因的猪模型的应用，证明了猪模型在生物医学领域的可适用性。该疾病的遗传因素已被明确识别，但现有的CFTR啮齿动物模型并没有表现出CFTR患者中观察到的典型症状，而猪具有较好的重现性[11]。与GGTA1基因敲除猪类似，将CFTR的定向破坏导入猪体细胞的基因组中，然后利用SCNT以产生CFTR基因敲除猪。当通过育种生产出同种猪模型时，猪（CFTR2/2）重现了CFTR患者的所有已知症状，证明了这种模型的实用性。但是由于体细胞的基因工程的效率极低，所有这些修饰都是以异种方式引入的，并且需要育种步骤来产生具有同种修饰的基因编辑猪。考虑到猪的妊娠期（114d）和达到性成熟天数（6个月左右），猪的一轮育种需要1年以上的时间。如果通过传统方法培养少量的初代猪，那么需要经过回交多个繁殖步骤，这将需要多年的育种计划来产生足够数量的基因编辑猪。此外，效率因供体细胞系的不同而有所差异。SCNT不仅高度费时并且技术难度大。更重要的是，通过SCNT出生的猪经常突然死亡或出现与SCNT过程相关的并发症。因此，SCNT引起的相关的并发症阻碍了通过育种来扩大基因编辑猪模型的数量。

由于传统的SCNT方法缺点较多，只有少量的基因编辑猪模型是通过SCNT生产的。因此，养猪界对提高基因编辑猪的生产效率产生了极大的兴趣。近10年来，基因组编辑技术的发展和应用极大地改变了基因编辑猪的设计和生产过程。

2 基因组编辑技术的研究进展

基因组编辑技术的应用改变了制备基因编辑猪的方法。基因组编辑技术的基础在于它能够识别基因组上的特定序列，并引入位点特异性双链断裂（DSB）。由于DSB对细胞是有害的，可能会导致细胞死亡。在这个过程中主要有两种DNA修复途径参与：非同源末端连接（NHEJ）或同源重组修复（HDR）。修复途径是一个有序的过程，每个修复途径中都有特定的蛋白质参与。因此，人们尝试利用化学抑制剂来调节NHEJ和HDR的效率。目前，有三种不同类型的基因组编辑系统：锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和成簇规则间隔短重复回文序列（CRISP/Cas9）系统。

ZFNs是第一个被开发用于修饰哺乳动物基因组的基因组编辑技术。在猪上，首次使用ZFNs破坏外源性绿色荧光蛋白（GFP）基因。具体来说，通过将ZFNs引入GFP阳性细胞中，导致GFP基因失活，并使用SCNT生产GFP基因敲除猪。通过在体细胞中引起GGTA1基因的定向修饰，并以该细胞作为SCNT的供体，产生GGTA1基因敲除猪。

与ZFNs的作用类似，TALENs能够识别并引起特定位点的DSBs，从而对基因组进行定向修饰。在选择基因组上的靶点位置时，TALENs更灵活。因为TALENs可以有效地识别富含AT的区域[15]，而ZFNs的活性则是在富含GC的靶区。2012年出现利用TALENs进行基因编辑猪生产的首次报道。该研究表明，TALENs可以有效地在猪基因组的各个位点上进行靶向修饰。在基因编辑猪生产中，使用TALENs的另一个重要报道则是在胚胎发生过程中引起靶向修饰。然而，由于ZFNs和TALENs的组装比较困难，这两种基因组编辑技术并不总是表现出很高特异性核酸酶活性。正是由于CRISPR/Cas9技术的开发，才大大减少了在猪体上使用基因组编辑技术所需的工作量。

CRISPR/Cas9系统在猪上首次应用是在体细胞中引起定向突变。次年，有项研究证明CRISPR/Cas9系统可用于生产基因编辑猪。这两项研究都将CRISPR/Cas9系统以mRNA形式导入发育中的胚胎中，通过NHEJ途径对基因组定向引起破坏。与ZFNs和TALENs报道的较低效率相比，将CRISPR/Cas9系统直接注射到猪胚胎中可以达到100%的基因修饰效率。其中一项研究还表明，将基因组靶向修饰的体细胞作为供体，通过SCNT成功生产基因编辑猪，证实了经CRISPR/Cas9系统修饰的体细胞在体内仍具有发育成个体的能力。

前人研究表明，CRISPR/Cas9系统可以用来有效地产生基因编辑猪，SCNT并不是生产携带定向修饰的GE猪的唯一途径。基因组编辑系统的应用，特别是CRISPR/Cas9系统，可以产生用于生物医学和农业的基因修饰猪。

3 猪模型在生物医学领域的应用

如前所述，第一批基因敲除猪被设计用于异种移植。现在，基因组编辑系统的使用允许引入对多个等位基因的编辑。使得快速生成携带多种遗传修饰的基因编辑猪，以改善异种移植的猪模型成为可能。例如，利用基因组编辑系统（ZFNs），产生了缺乏GGTA1和胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH）的基因编辑猪，以减少异种移植后发生的免疫排斥反应。此外，CRISPR/Cas9系统可以生产携带修饰的GGTA1、CMAH和β-1，4-N-乙酰-半乳糖胺酰转移酶2（b4GalNT2）的三重基因敲除猪。来自GGTA1/CMAH/ b4GalNT2-基因敲除猪的血清中减少了与人类抗体的结合。如果使用传统的基因工程方法并结合育种步骤制备这些双重或三重基因敲除猪则通常需要花费长达几年的时间。在异种移植领域使用基因组编辑系统时，另一个重要的优点是破坏了可能在异种移植后传染给患者的猪病毒序列。有报道称，CRISPR/Cas9系统可对猪内源性逆转录病毒（PERVs）序列进行全基因组破坏。CRISPR/Cas9系统在猪体细胞基因组中对PERV序列的全部62个拷贝插入修饰。当体细胞用于SCNT时，产生了PERV失活的基因编辑猪，从猪身上没有观察到健康问题。最近发表的一篇文章表明，来自基因编辑猪的心脏可以具有非人类灵长类动物的心脏功能，基因编辑猪的器官移植将在不久的将来可能会进入临床应用阶段。基因组编辑技术的发展有助于生产免疫缺陷型的GE猪。缺乏免疫系统的动物模型可用于疫苗的开发，研究感染和细胞移植时的发病机制和免疫反应。

4 基因组编辑猪在农业生产中的应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的爆发给养猪业造成了相当大的损失，针对该病毒的疫苗往往效果欠佳。通过应用基因组编辑系统，特别是CRISPR/Cas9系统的使用，促进了对CD163的定向破坏，已知CD163是PRRSV发病的潜在关键受体。CD163基因敲除猪用于PRRSV的研究时，发现猪对病毒完全具有抗性，将此基因编辑猪引入生产将显著提高生产者经济效益。采用类似的策略，通过破坏推测的受体氨基肽酶N（ANPEP）来产生对传染性胃肠炎病毒具有抗性的猪。这些研究证明，利用基因组编辑系统生产的基因编辑猪可以对病毒产生抗性，从而显著提高猪的生产和经济效益。

培育含有肌肉生长抑制素（MSTN）基因修饰的猪也是农业生产应用之一。该基因在肌肉发育过程中起着抑制肌肉发育的调节作用。自然发生的MSTN突变已经在许多物种中被识别出来，包括牛，著名的比利时蓝牛和山羊。使用ZFNs或TALENs对猪的MSTN进行靶向性破坏，可获得更好的饲养效率和生长速度以及更高的肌肉质量。此外，利用CRISPR/Cas9系统改变猪的生理状况，可以提高猪的生产力。已知解偶联蛋白1（UCP1）基因是棕色脂肪组织介导的产热的关键基因，但猪通过进化已失去其功能。通过CRISPR/Cas9介导的HDR途径，用功能性鼠UCP1基因替换猪内源性UCP1基因，从而提高仔猪抵御寒冷的能力，并有助于能量稳态的调节。

5 总结

近些年来基因组编辑技术的发展扩大了基因编辑猪在农业和生物医学领域的应用范围。使用基因组编辑系统可以实现基因编辑猪的快速生产。猪的体外胚胎生产基因编辑猪效率已得到显著改善，这有得益于使用直接胚胎注射的方法。这些基因组编辑技术的进步，为基因的复杂修饰奠定了基础，可以提高农业和生物医学中基因修饰猪的产量。