Th9细胞在炎症免疫疾病及肿瘤疾病中有多样作用

隋晓，李芹芝，郭新红

（新疆医科大学第一临床医学院 新疆医科大学第一附属医院血液病中心，新疆 乌鲁木齐）

0 引言

Th9细胞是近年发现的一类新型辅助T细胞，主要分泌细胞因子IL-9，在炎症免疫疾病、肿瘤疾病、寄生虫病等疾病中发挥重要作用。对其的深入研究有助于开辟疾病治疗新靶点。

1 Th9细胞及细胞因子IL-9的发现

20世纪初，由 Kuchroo 实验室和 Stockinger实验室同时发表证实发现的一种新型辅助T细胞[1]，最初被认为是一种Th2类细胞，其分泌的细胞因子最初被认为是一种T细胞的促生长因子。后发现Th9细胞可由TGF-β及IL-4诱导产生，能分泌IL-9及IL-10，二次刺激后也产生其他细胞因子特别是 IL-10、IL-17、IL-21和IL-22 等，而不分泌IL-4、IL-5和IL-13等Th2类细胞因子[2]。通过胞内染色检测发现，分泌IL-9和IL-10的新型细胞亚群并不表达已知的任何一种转录因子，如T-bet、GATA-3、RORγt和Foxp3，表明这群细胞与Th1、Th2、Thl7及Treg细胞等不同，并不属于目前所发现的任何一种辅助T细胞亚群，后将此群细胞单独培养，发现其特异性转录因子属于EST家族的PU.1，这群细胞被称为“Th9细胞”[1]。

2 Th9细胞的诱导分化及IL-9的表达

Th9细 胞 可 由CD4+的 初 始T细 胞 在TGF-β及IL-4条 件下诱导产生，已经分化成熟的Th2细胞可在TGF-β的诱导下产生Th9细胞[3]，IL-2对Th9细胞的存在具有重要意义：IL-2阴性的环境下，Th9细胞的表达明显减少。TGF-β存在条件下可抑制CD4+的初始T细胞向Th2细胞分化，IL-4存在条件下可抑制CD4+的初始T细胞向Treg细胞分化，由此可见，CD4+的初始T细胞分化成Th9细胞需要TGF-β及IL-4的共同参与。通过对小鼠IL-9基因的分子特征分析，发现该基因位于13号染色体，而它的人类同源基因位于q31-35区域的Th2细胞因子簇(IL-2、IL-4、GM-CSF和IL-13)的5号染色体上[4]。在调控IL-9基因表达上，EST家族的调控转录因子PU.1可以直接作用IL-9基因，并且是Th9发育必要的因子。研究表明，在敲除PU.1基因T细胞的小鼠，即使在培养时加入特异诱导因子IL-4和TGF-β，IL-9在外周血的表达也下调，说明PU.1因子为调控T细胞分泌IL-9的重要转录因子，但PU.1并不只表达于Th9细胞，还有B细胞[5]。干扰素调节因子4(IFNregulatoryfactor4，IRF4)也是分泌IL-9的重要调控转录因子，但与PU.1不同。IRF4可以直接调控IL-9基因，能上调IL-9，并且也能上调IL-2、IL-4和TGF-β等因子的表达。在LPS和IL-1的共同参与下，肥大细胞也能作用IL-9的基因，上调IL-9表达。其他细胞因子、细胞通路也可影响IL-9的表达，如TGF-β虽然能上调IL-9的表达，但是同时也能诱导出Treg和Thl7细胞分泌IL-9。肿瘤坏死因子样配体1A(tumor necrosis factor-like ligand 1A，TL1A)及其受体死亡受体3(death domain receptor 3，DR3)相互作用可以扩大Th9细胞的表达量，需要三种因素的参与，包括IL-4和信号转导子和转录激活子6(signal transducers and activators of transcriptions 6，STAT6)；IL-2和STAT5；还有肿瘤坏死因子β信号，IFN-γ对IL-9的产生有抑制作用[6]。一氧化氮(nitric oxide，NO)可以使得小鼠双微基因2(murine double-minute 2，Mdm2)抑制p53基因，通过IL-2-STAT5途径增加IRF4促进Th9细胞的分化[7]。除此之外，BATF可激活Th亚群中的家族特异性细胞因子，激活Th9细胞中的IL-9，在原代小鼠T细胞培养中观察到JunB和c-Jun促进了Th9细胞中IL-9的产生，而JunD则没有。无论是JunB还是c-Jun，均可使Th17细胞中IL-9的异位表达量适度但显著增加。Bach2通过直接与IL-9基因结合，增加Th9细胞中转录因子的表达，正向调节IL-9的产生。引人注目的是，Bach2和BATF的共转导显著地诱导了Th9和Th17细胞中IL-9的产生[8]。在正常的Th9培养中，抑制STAT3可以减少早期IL-21的诱导和晚期IL-9的产生，而外源性IL-21通过恢复抑制细胞因子信号转导3的表达，从而抑制过度磷酸化的信号转导和转录激活因子(p-STAT)1的激活，增强了Th9的分化。Zhang等通过检测STAT3功能缺失和STAT1功能获得突变患者的IL-9水平和Th9分化，以及Th9转录因子，添加缺失的细胞因子或转染关键分子，在体外部分挽救了他们的缺失。提示STAT是Th9分化及IL-9产生的重要信号因子[9]。Ma C等人的研究显示，Balb/c小鼠不仅Th细胞产生IL-9，而且CD3-CD49b+NKp46+NK细胞也产生IL-9。激活素A虽然能促进CD4+Th细胞中IL-9的表达，但却能抑制小鼠CD49b+NKp46+NK细胞中IL-9的产生。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，小鼠NK细胞可分泌成熟的IL-9蛋白，激活素A可抑制NK细胞对IL-9的释放。活化素a处理的脾NK细胞中活化素型IIA受体(ActRIIA)、Smad3和磷酸化Smad3 (p-SMAD3)蛋白水平较对照组升高。激活素A对NK细胞产生IL-9的抑制作用在激活素拮抗剂FST或Smad3敲除NK细胞时减弱。虽然激活素A上调了Th细胞中IL-9的表达，但它通过Smad3信号传导抑制了NK细胞中IL-9的产生[10]。T细胞的激活和分化依赖于好氧糖酵解，而不是氧化磷酸化，以满足其增加的生物合成能量需求[11]。数据表明，与其他Th亚群相比，人类Th9细胞产生的乳酸水平明显更高。补充的eATP与TGF-β1和IL - 4进一步加强IL-9生产Th9细胞，且增强了IRF4的表达，通过阻断试验等进一步确定了ATP-一氧化氮通过加强mTOR-HIF-1α-mediated途径诱导人类Th9细胞分化产生IL-9[11-12]。

3 Th9细胞在炎症免疫性疾病中的作用

炎症及免疫性疾病发病机制复杂，Th9细胞作为辅助T细胞通过分泌细胞因子IL-9发挥重要作用。Th9细胞参与过敏反应，通过抑制嗜酸性粒细胞凋亡导致过敏性哮喘，T细胞缺失的小鼠导入卵清蛋白诱导的外源性Th9 细胞，小鼠会出现严重哮喘症状，而哮喘症状能被 IL-9抗体治疗；Wang D等人通过体内、体外实验及动物实验证实TL1A通过增加Th9细胞、IL-9和pu.1的表达在慢性DSS结肠炎模型中加重了肠道炎症[13]；Th9细胞已成为过敏性气道炎症的重要介质。有证据表明，蛋白激酶GCN2蛋白GCN2缺乏显著抑制Th9细胞的分化，但不抑制Th1、Th2和调节性T细胞的分化。分离的GCN2缺陷Th9细胞也可介导过继性气道炎症反应，GCN2敲除小鼠和重组激活基因2敲除(Rag2KO)小鼠接受过继转移的GCN2缺陷CD4+ T细胞后，Th9分化减少，气道过敏性炎症减轻。抑制GCN2活性的新策略可能为减轻过敏性气道炎症提供新的途径[14]。原发免疫性血小板减少症（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是常见的自身免疫性疾病，周等人通过检测Th9细胞数目及IL-9的表达，结果提示Th9细胞及IL-9的表达均增高，且与血小板的数目呈负性相关，表明其可能参与了ITP的发病[15]。外源性重组大鼠IL-9 (rrIL-9)作为IL-9受体拮抗剂，通过改变Th亚群分布，降低了大鼠实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)的发生率，减轻了疾病的严重程度，降低了抗乙酰胆碱受体(AChR) IgG抗体水平。这些数据表明，给药rrIL-9可能为MG或相关自身免疫性疾病提供一种新的治疗策略[16]。目前，许多证据表明肥大细胞在多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS）及其动物模型中起着重要作用，越来越多的证据表明Th9细胞参与了MS的发病机制，此外，Th9与肥大细胞的相互作用已在其他自身免疫性疾病中得到证实[17]。抗IL-9抗体治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）发现抗体产生减少，且中枢系统肥大细胞的数目及其趋化因子明显减少。提示IL-9参与了MS的发病，且可能为治疗的新靶点[18]。食管炎(EoE)是近年来发现的一种食管炎症性疾病，EoE患者食道中有大量的嗜酸性粒细胞，大部分嗜酸性粒细胞与辅助性2型(Th2)相关。另外部分嗜酸性炎症是由T细胞的其他亚群控制的，如Th9或Th17[19]。Wang P等人利用野生型p53诱导的磷酸酶1 (Wip1)基因敲除小鼠、Wip1抑制剂处理小鼠和卵清蛋白诱导的过敏性气道炎症小鼠模型来表征Wip1在过敏性气道炎症中的作用，证明wip1缺陷的小鼠不容易发生过敏性气道炎症，这是由肺部病理改变的减少所显示的。短期治疗与wip1特异性抑制剂显着改善过敏炎症进展。Wip1选择性地损伤了Th9，但没有损伤Th1、Th2和Th17细胞的分化。生化分析显示，Wip1缺失增加了c-Jun/c-Fos活性，呈c-Jun N端激酶依赖性，c-Jun/c-Fos直接与IL-9启动子结合，抑制IL-9转录。Wip1通过调节IL-9启动子上的c-Jun/c-Fos活性来控制Th9细胞的发育，对变应性气道炎症的发病机制具有重要意义。这些发现阐明了Wip1在Th9细胞分化中的作用。Wip1抑制剂对过敏性气道炎症发病机制的抑制作用对其在变态反应治疗中的临床应用具有重要意义[20]。白塞病(Behcet disease，BD)是一种多系统疾病，其临床表现以肺复旧为特征。BD患者Th9细胞百分率、绝对数、pu.1、IL-9表达水平均较对照组明显升高。与非活动期BD患者相比，活动期BD患者的Th9细胞绝对数明显增加。这些参数在伴有肺表现的BD患者的BAL中显著表达。在非活动期的BD患者中，皮质类固醇治疗后，该细胞因子三件套降低，Th9细胞亚群的扩增、pu1转录因子的上调、IL-9细胞因子的分泌增加可能是BD的发病机制之一，与Th9表达相关的IL-9水平取决于BD的严重程度。以上结果提示IL-9在BD发病机制中起重要作用，尤其是在肺受累患者中[21]。以上证据均表明Th9细胞及其细胞因子IL-9在炎症及自身免疫性疾病中均有重要的作用，抗IL-9抗体在动物模型中的应用均提示Th9细胞及IL-9可能成为治疗的有效靶点。

4 Th9细胞及IL-9在肿瘤疾病的作用

Th9细胞及其细胞因子IL-9在肿瘤疾病中的作用是多样化的，既有致瘤功能，又有抗致瘤特性。通过研究体外肿瘤细胞系，发现IL-9介导独立T细胞增殖，并通过自分泌环保护T细胞凋亡[22]。其抗致瘤作用可能通过CD8+细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells，CTL）实现。Th9细胞通过在肺上皮细胞上表达的趋化因子CCL20趋化作用，激发CD8+ CTL介导的抗肿瘤免疫。这提示Th9细胞在抗肿瘤免疫中为效应体和/或记忆性CD8+ CTL的产生提供了帮助[23]。在结肠癌的研究中发现，将IL-9表达水平与肿瘤的不同分期做相关性分析，提示IL-9表达水平降低与结肠癌的进展相关[24]。与健康对照组相比，CRC患者血浆和CRC组织中IL-9的表达水平较低，且与TNM分期显著相关。与早期相比，晚期CRC患者IL-9水平降低[25-26]。宫颈癌是发展中国家妇女最常见的癌症之一。持续感染高危人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌发生的主要决定因素。有研究表明宫颈上皮内瘤变（Cervical Intraepithelial Neoplasia，CIN）患者组织活检标本中pu.1 阳性细胞大量浸润，IL-9R过表达。用Th9信号细胞因子IL-9和IL-21处理，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。Th9似乎通过T细胞毒性增强抗肿瘤免疫反应，并在控制恶性细胞转化中发挥关键作用[27]。最近，Cai等人的一项研究发现，重组IL-9治疗胃癌裸鼠血清IL-9、IL-21和pu.1水平降低。除IL-9表达降低外，IL-4、IL-10、IL-25表达降低。提示IL-9在胃癌中具有潜在的致瘤作用[28]。波兰的一项研究表明104例CRC患者的血清IL-9水平明显高于对照组，提示在CRC患者中也可能存在Th9的致瘤作用[29]。由炎症性肠病引起的结直肠癌被称为大肠杆菌相关癌(CAC)。通过研究包括12例结直肠组织标本和来自CAC的邻近组织，利用免疫组化染色检测IL-9蛋白的表达发现IL-9在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。IL-9通过上调c-Myc和cyclinD1的表达，促进结肠上皮RKO和Caco2细胞的增殖[30]。

5 在寄生虫病中的作用

Th9细胞及其细胞因子IL-9在寄生虫病中的作用研究不少，但具体机制尚不明确。由血吸虫引起的肝纤维化是由一个复杂的细胞因子网络调节的。IL-9可能在血吸虫病早期肝纤维化的调节中发挥作用，成为调节血吸虫病肝纤维化的一种有前途的方法。体内研究发现，IL-9的中和作用减少了虫卵周围的肝肉芽肿性炎症和胶原沉积。体外研究发现，主要的治疗与IL-9诱导肝星状细胞的胶原蛋白和α-smooth-muscle肌动蛋白显著增加。在日本血吸虫感染小鼠中IL-9可能比IL-4出现得更快，且水平更高[31]。囊性棘球蚴病(CE)是由细粒棘球蚴(Eg)感染引起的人畜共患病。TGF-β的水平、p-Samd3、 PU.1和IL-9在CE患者的肝脏均升高。IL-9和IL-9R在感染的肝脏组织中表达升高，IL-9水平与肝脏炎症呈正相关。抗原b刺激肝囊型包虫病患者的淋巴细胞，上清液中IL-4、IL-9、TGF-β和IL - 10的表达也显著增加，在体外阻断TGF-β/smad通路信号后，PU.1和IL-9表达明显减少，由此可知，TGF-β/smad信号通路是Th9细胞分化及IL-9致病的重要信号通路[32]。

6 结语

Th9细胞是一类新型辅助T细胞亚群，其分化受多种信号分子调节，通过分泌 IL-9等炎性因子在变态反应性疾病、自身免疫性疾病及肿瘤疾病、寄生虫疾病等诸多病变的发病机制和病情进展中发挥重要作用，作用机制复杂，进行Th9细胞相关的更多研究，对进一步揭示疾病的发病机制、对疾病诊断及治疗新靶点的探索均有重要意义。