外泌体微小RNA在慢性肾脏病中的研究进展

陈 笑, 聂安琪, 刘 静, 陆宇晴, 石嘉琪, 陈晓岚

(南通大学附属医院 肾内科, 江苏 南通, 226000)

慢性肾脏疾病(CKD)是一个高度流行的公共卫生问题，其发病率在全球范围内迅速增高，其中多数患者发展为终末期肾衰竭，主要组织学表现为肾小球硬化和小管间质纤维化。CKD成为继心脑血管疾病、糖尿病外另一个人类重要的致死原因之一[1]。肾脏微血管内皮细胞损伤、炎症反应、间质纤维化是发生CKD的主要原因。为了提高CKD患者的生存质量，改善CKD患者预后，应寻找CKD早期诊断的途径和新型有效的治疗方法。外泌体在缺氧、高糖等生化刺激下分泌异常，并以自分泌、旁分泌、远分泌的方式将其包裹的信号物质传送到靶细胞，参与肾脏生理、肾脏细胞损伤和修复、免疫反应以及间质纤维化等病理过程[2]。相关研究[3]表明，外泌体衍生的微小RNA(miRNA)不仅可作为诊断和预后评估CKD的敏感生物标志物，还可用于CKD的治疗。本综述重点探讨不同来源的外泌体miRNA对CKD的作用机制及在治疗中的作用，并展望该领域的发展前景。

1 外泌体和miRNA的概念

近年来，外泌体成为了研究热点，其最早于1987年由JOHNSTONE RM等[4]在研究绵羊网织红细胞成熟过程中发现。外泌体是一种由细胞分泌且具有脂质双层膜结构的球型纳米级胞外囊泡，直径50～100 nm, 表面含有多种跨膜蛋白如CD63、CD9、肿瘤易感基因101(TSG101)等表面特异性蛋白，介导外泌体识别靶细胞。外泌体内部存在蛋白质、DNA、非编码RNA[miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)]和脂质等多种“货物”。外泌体可作为纳米载体介导细胞间的信息传递，主要有以下4种方式: ① 外泌体作为信号复合物，通过配体-受体介导方式刺激受体细胞; ② 外泌体在细胞间转移受体; ③ 外泌体向受体细胞转移功能蛋白或传染性颗粒; ④ 外泌体通过膜融合方式向受体细胞传递信使RNA(mRNA)、miRNA或转录因子等物质[5]。其中外泌体衍生的miRNA最早由VALADI H等[6]于2007年发现。miRNA为一类非转录的RNA，长度约19～22个核苷酸，通过与靶基因mRNA 3′端非编码区(UTR)(3′-UTR)结合，调节多种基因的转录从而抑制其他蛋白mRNA的表达[7]。目前，在外泌体中已发现2838种miRNA, 且miRNA选择性富集，通过检测外泌体中特异miRNA来监测疾病进程成为可能。外泌体miRNA在CKD中发挥重要调节作用，其异常表达与CKD发生发展密切相关。

2 不同来源外泌体miRNA对CKD发生发展的作用

外泌体的来源十分广泛，由多种细胞分泌，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和间充质干细胞等，并且存在于人体内多数体液中如血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、泪液、胸腔液、腹腔积液等。目前对CKD的作用机制相关的外泌体miRNA主要来源于肾小管上皮细胞(TECs)、间充质干细胞(MSCs)、血清、尿液。

2.1 来源TECs的外泌体miRNA

TECs是肾细胞中含量最多的细胞，发挥多种调节功能。TECs是缺氧、蛋白尿、毒素、代谢紊乱和衰老的最初损伤部位。CKD患者体内维持低水平的慢性炎性反应，即“微炎症状态”，影响CKD的发展。巨噬细胞是促进肾脏炎症和纤维化的关键炎症细胞，在DKD发展过程中，巨噬细胞主要表现为M1型，可释放炎症因子，促进肾脏纤维化。JIA Y等[8]研究发现，随着糖尿病肾病(DN)的发展，糖尿病小鼠肾组织中M1巨噬细胞相关标志物增加，人血清白蛋白(HSA)诱导的近曲小管上皮细胞(HK-2)胞外囊泡(EVs)与巨噬细胞诱导的巨噬细胞M1在脂多糖(LPS)存在下极化，并且发现来自HSA刺激HK-2细胞衍生EV的miR-199a-5p通过靶向Klotho/TLR4途径诱导M1极化并进一步加速DN的进展。LV LL等[9]对小鼠急性肾损伤(AKI)模型和CKD模型研究结果发现，另一种来源TECs的外泌体miR-19b-3p同样介导受损TECs和巨噬细胞之间的通讯，导致M1巨噬细胞活化，促进炎症反应发生。SHAO X等[10]研究发现miR-30b通过诱导细胞凋亡、释放炎性细胞因子、削弱自噬过程来促进LPS诱导HK-2细胞发生炎性损伤。但ZHANG L等[11]研究表明来源TSCs的外泌体miR-20a通过调控细胞凋亡和炎性细胞因子释放来抑制LPS诱导HK-2细胞损伤，且进一步发现miR-20a通过靶向血清趋化因子配体12(CXCL12)来抑制核因子NF-κB和调控细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路，进而抑制LPS诱导HK-2细胞损伤。提示来源TECs的外泌体miRNA在调节CKD微炎症状态中有重要作用。

2.2 来源MSCs的外泌体miRNA

干细胞使组织具有再生能力并能在大多数损伤中幸存。MSCs是研究最多的干细胞之一。人MSCs由多种组织分离，包括骨髓和脂肪组织。急性肾损伤(AKI)使患者罹患进行性CKD的风险增加。ZHU F等[12]发现转录因子Sox9在包括肾脏在内的多种组织器官的发育中起着至关重要的作用，人类脂肪MSCs采用外泌体通过肾小管上皮细胞依赖性Sox9激活来减少AKI和抑制CKD进展。MSCs衍生的EVs在不同的肾损伤动物模型中均具有促再生潜能。EVs包含蛋白质、脂质和核酸，其中miRNA在EVs的再生潜能中具有重要作用。COLLINO F等[13]观察到MSCs和EVs中的miRNA缺失可显著降低AKI患者的内在再生潜能，提示miRNA在AKI后的恢复中起着关键作用。TAPPARO M等[14]对经MSCs衍生EVs和未经处理的AKI小鼠肾脏分子进行了RNA测序分析，测得的miRNA与在MSCs衍生的EVs中表达增加的50个miRNA进行后交叉匹配，鉴定出以下miRNA: miR-10a-5p、miR-127-3p、miR-29a-3p、let-7a和miR-30a-5p、miR-486-5p。为了评估所选miRNA促进小管细胞增殖的潜力，用miRNA模拟物处理小鼠小管上皮细胞，并置于缺氧/复氧条件下，所选miRNA可增殖，用特异性miRNA模拟物电穿孔瞬时转染MSCs, 分析表明，转染后MSCs和衍生的EVs有效富集了所选miRNA。体内、体外实验表明，含有miRNA的EVs能保持其促再生作用。肾小球和肾小管间质纤维化是CKD的特征之一。上皮-间质转化(EMT)是纤维化的一个关键过程，单侧输尿管阻塞(UUO)已被广泛用作肾纤维化的模型，具有诱导肾纤维化快速发展的优势，同时还可以模拟间质纤维化的细胞进展过程[15]。HE J等[16]研究发现在UUO小鼠模型中来源MSCs的外泌体的可显著改善体内、体外的治疗效果，且优于单纯MSCs, 保护小鼠免受EMT和肾功能衰竭的侵害。同时也发现相关miRNA对肾脏有保护作用，其参与调控转化生长因子-β(TGF-β)信号通路和纤维化机制。对于MSCs对肾脏的保护作用，尤其是抑制肾纤维化过程, WANG B等[17]也观察到MSCs的外泌体可选择性转移miR-let7c至受损的肾细胞，从而导致肾纤维化减缓。目前，多项研究表明MSCs衍生的EVs具有促再生潜能，来源MSCs的外泌体可以减缓AKI向CKD进展，且相关miRNA参与肾脏保护，但具体保护机制仍需进一步明确。

2.3 来源血清的miRNA

在血清中寻找外泌体，具有创伤小、简便快捷、费用低廉等优点，且血清miRNA相对稳定，不易降解，所以miRNA作为血清标志物的越来越受到关注。肾脏纤维化几乎发生在所有类型的慢性肾脏疾病中。ZHANG A等[18]在UUO小鼠模型中发现，血清外泌体携带的miR-26a通过抑制结缔组织生长因子(CTGF)来限制肾纤维化。KIM H[19]通过与健康志愿者相比，发现DN患者的血清外泌体miRNA let-7c-5p明显上调。有研究[20-21]表明, miRNA let-7家族成员(let-7b和let-7c)通过调节TGF-β信号传导在DM的肾纤维化中发挥功能性作用，提示miRNA let-7c-5p水平的上调可能是一种生理反应，可限制肾脏纤维化的发生。FAN Q等[22]选取了50例经肾活检证实为IgA肾病的患者和25例健康志愿者，发现IgA肾病患者的血清和肾内miR-192表达低于正常对照组，在其进展过程中也观察到miR-192水平的下调，表明IgA肾病患者血清miR-192表达量降低，肾小管萎缩，间质性炎症和纤维化趋势增加。血清外泌体携带的miRNA对肾脏有保护作用，可以限制肾脏纤维化，在CKD的早期诊断和病情进展中，有望成为新的生物标志物。

2.4 来源尿液的miRNA

相比骨髓穿刺、肾穿刺活检、抽血等有创检查，从尿液中寻找外泌体miRNA作为非侵入性诊断依据，不仅对患者的耐受性要求低，同时可提高患者的依从性。CKD的基本病理变化为肾小球硬化和肾间质纤维化, WANG B等[23]发现TGF-β1通过抑制miRNA-29的表达促进肾纤维化。LV LL等[24]选取32例接受肾脏活检的CKD患者尿液和7例对照组尿液，发现miR-29c水平随纤维化程度增加而降低，尿液外泌体中miR-29c的检测表明其有可转化为临床生物标志物。LV CY等[25]通过对35例肾纤维化患者和20例非肾纤维化患者尿液miRNAs研究结论与上述结果一致, miR-29c水平与肾纤维化程度呈负相关，且miR-29c与纤维化形成的后期密切相关, miR-21与纤维化形成的早期紧密相关。相关研究[26]发现除了miR-29c水平降低与肾纤维化有关，具有较高稳定性和较高诊断价值外，尿外泌体miR-21水平在超早期纤维化中显著升高(纤维化程度为0%～5%), 但随着纤维化程度的增加，尿外泌体中miR-21的水平略有降低(轻度纤维化组)，然后略有升高(中度和重度纤维化组)。尿外泌体miRNA可以作为新型肾纤维化的非侵入型标志物，参与CKD的诊断和判断预后。

3 外泌体miRNA在CKD治疗中的作用

目前对CKD的治疗主要集中在减缓疾病进展方面，尽管有良好的效果，但不足以对抗疾病的演变。多数终末期肾病患者需进行血液透析或肾脏替代治疗，后者成本高且器官可获得性差[27]。因此，寻找新型有效的治疗方法成为了现阶段的研究关键。LI ZL等[28]研究发现，肾小管缺氧诱导因子-1通过外泌体介导的TECs和巨噬细胞间的通讯刺激肾间质炎症。肾小管缺氧诱导因子-1a通过外泌体miRNA-23a转移促进巨噬细胞活化，抑制髓细胞A20。此发现为低氧损伤和肾间质炎症在肾脏中的交叉机制提供了理论依据，阻断miRNA-23a信号可为治疗肾脏病(缺氧导致)的靶点。YU J等[29]研究发现，hsa-miR-3607-3p和hsa-miR-4709-3p可能为治疗肾纤维化的靶点。肾间质纤维化的特征是EMT和细胞外基质沉积过多，非编码RNA心肌梗死相关转录本(MIAT)通过调节miR-145/EIF5A2轴来增殖细胞，为肾间质纤维化建立了潜在的疗法[30]。

DN是糖尿病的严重并发症，也是CKD的主要原因之一。足细胞是肾小球内的一种常驻细胞，对于维持肾小球滤过功能起着重要作用[31]。足细胞在糖尿病肾病损伤中，会发生肥大、EMT、脱离和凋亡等形态变化[32]。HUANG H[33]等研究证实M2巨噬细胞可以通过分泌外泌体miR-25-3p来改善高糖(HG)诱导的足细胞损伤，抑制(双特异性磷脂酶1)DUSP1的表达来激活细胞自噬。足细胞迁移参与蛋白尿产生的过程，与DN的发生相关。脂肪干细胞的外泌体(ADSCs-Exo)miR-251-5p是ADSCs-Exo介导的足细胞损伤过程中起保护作用的关键因素。抑制miR-251-5p限制了ADSCs-Exo对HG诱导的增殖抑制和迁移促进的改善，且单独的miR-215-5p模拟物可显著逆转HG诱导的足细胞EMT过程[34]。巨噬细胞和脂肪干细胞衍生的外泌体，有望作为DN的新型潜在治疗靶点。

MCSs具有无限复制潜力，以及体外分化为中胚层组织成熟细胞的能力。这些细胞主要与其抑制炎症和激活组织再生的能力有关[35]。EBRAHIM N等[36]调节糖尿病小鼠模型中的自噬、纤维化标记物，采用MSCs衍生的外泌体治疗，改善肾功能并修复受损肾组织。血管钙化是CKD患者的常见并发症，骨髓MSCs衍生的外泌体可通过修饰miRNA减缓高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化[37]。外源性间充质干细胞治疗可改善AKI，但探讨MSCs治疗CKD的潜在优势相关研究较少，且其用于临床治疗的安全性仍需进一步确认。

4 小结和展望

外泌体是内含蛋白质、非编码RNA、脂质等的细胞外囊泡，在相关疾病的生理与病理过程中发挥重要作用，且可以多种方式传递信息，外泌体中的miRNA可与靶基因结合调控基因表达。研究显示外泌体可作用于CKD的发生发展，检测外泌体miRNA有助于CKD的诊断和治疗。不同来源的外泌体miRNA在CKD中发挥的作用存在差异，与肾小管间质纤维化、炎症程度等有密切联系。体内体外实验表明，外泌体miRNA有望成为CKD早期诊断的标志物，但其作用机制尚未明确，仍需对外泌体miRNA进行研究，为治疗慢性肾病提供可靠、成熟的理论依据，以期早期诊断患者并改善预后。