研究胆碱能受体激动剂对天疱疮棘层松解的逆转作用及其机制

艾洁

（内蒙古包头市肿瘤医院，内蒙古 包头）

0 引言

天疱疮是一类原因尚未明确的自身免疫性大疱性疾病类型，临床上一般选用足量糖皮质激素予以治疗，若病情过于严重者可行血浆交换疗法，一般寻常性天疱疮可经久不愈。天疱疮多发于老年群体，病程较为缓慢，病情进展缓慢时，虽不致命，但病情严重且经常复发的情况下，便可危及生命，因此需选用具有及时性和针对性的临床治疗手段实行相应治疗，缓解并控制病情，积极促进病情转优。选用糖皮质激素进行治疗可有效缓解天疱疮患者的皮肤症状，降低天疱疮导致的病死率，同时积极促进病情转优，但选用糖皮质激素予以治疗会发生不确定性的不良反应，若不良反应太过严重，会直接危及天疱疮患者的生命安全，不仅不能降低天疱疮的病死率，反而会因不良反应使病死率持续增长[1-3]。有相关研究表明，乙酰胆碱液可在改善天疱疮患者的临床症状中发挥一定效用，胆碱能激动剂对棘层松解有一定程度的抑制作用，但目前还未明确具体作用机制，因而本次研究决定对天疱疮棘层松解的相关情况进行针对性的探究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

抽取某院皮肤科2017 年2 月至2020 年2 月收治的46 例天疱疮患者参与研究调查，年龄在20～75 岁，平均（50.23±6.19）岁。

1.2 方法及标准

参照《2014 EDF/EADV 天疱疮诊断和治疗指南（s2）-皮肤性指南》制定标准：正常HaCaT 细胞（中国医学科皮肤病研究所提供）和10% 胎牛血清-DMEM 培养液（美国Life Technnologies 公司提供）。将寻常型天疱疮患者和正常体检者血清纯化后可得寻常型和正常型的IgG（免疫球蛋白G），浓缩后可得20 g/L 的IgG，桥粒芯蛋白抗体--653 U/mL，Dsg1 抗体--343 U/mL，免疫球蛋白G 的终浓度--1g/L[4-5]。

实验所用试剂--卡巴胆碱（美国Sigma-Aldrich 公司）；分散酶Ⅱ；上样缓冲液、鼠抗人Dsg3 抗体、MOPS 电泳缓冲液、Trizol、Bis-tris 预制胶（美国Life Technnologies 公司）；磷酸化p38 MAPK、磷酸化EGFR 抗体、表皮生长因子受体（美国Cell Signal Technology 公司）、免疫印迹洗脱液、免疫共沉淀试剂盒（美国Thermo Fisher scientific 公司）；鼠抗人桥斑珠蛋白抗体（美国BD 公司）；HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体、Triton X-100 裂解液、RIPA 裂解液、HRP 标记山羊抗小鼠IgG 抗体；qPCR 试剂盒；桥粒芯蛋白抗体检测试剂盒；逆转录试剂盒等各项所用试剂。

分组--将HaCaT 细胞培养后进行合适分组（至80%时划分）：正常组；PV-IgG 组；NH-IgG+ 卡板胆碱和PV-IgG+卡巴胆碱组[6-7]。

HaCaT 细胞解离实验-- 用磷酸盐缓冲液冲洗HaCaT细胞，加入分散酶Ⅱ后放于37° 的孵箱中，30 min 后，将培养皿与细胞单层相分离，最后在机械力的作用下使细胞出现解离。

免疫荧光-- 细胞经处理清洗后，加入4% 的多聚甲醛固定10 min；清洗后，加入0.1% Triton X-1005 min 后再清洗。加入抗体孵育1 h，二抗45 min；加入7.5 mg/L Hoeches 33342 染色，标记细胞核。

蛋白抽提--HaCaT 细胞清洗后，加入Triton X-100 裂解液或RIPA，裂解细胞，当HaCaT 细胞全面裂解后，将细胞裂解出的膜蛋白和胞质蛋白抽提出来；将抽提后的温度维持在4 ℃左右，待5 min 后，在培养皿的一端迅速将细胞裂解液快速刮于其上（选用细胞刮），吸至离心管中，离心15 min 后收集上清液。

免疫印迹-- 蛋白定量后，混合提取后的蛋白与上样缓冲液，加热变性后上样。一系列正常操作后，三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液洗去未结合二抗后，选用化学发光法在凝胶成像仪上观察各自条带。

不同细胞表面蛋白mRNA 表达--细胞用PBS 清洗两次后，提取RNA，浓度测定选用蛋白核酸分析仪，后续依照逆转录试剂盒说明操作。

免疫共沉淀--按照免疫共沉淀试剂盒说明书流程操作。

1.3 统计学方法

利用S P S S 1 8.0 软件分析、处理，用t检验计量资料（±s），P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

①卡巴胆碱逆转天疱疮棘层松解--寻常型天疱疮组细胞碎片数目：（46.58±2.01）；正常组：（5.02±0.57）。免疫荧光实验中，寻常型天疱疮组Dsg3 和PG 均出现细胞内聚集现象；②卡巴胆碱影响Dsg3 和PG 之间的相互作用--免疫共沉淀实验，HaCaT 细胞在PV-IgG 作用下，Dsg3 减少；加入卡巴胆碱后，Dsg3 恢复正常水平；③卡巴胆碱影响棘层松解相关信号分子磷酸化水平--HaCaT 细胞p38MAPK 在PV-IgG作用下与EGFR 发生磷酸化；加入卡巴胆碱后，p38MAPK 水平未变化，抑制EGFR 的磷酸化；④卡巴胆碱影响桥粒分子mRNA 水平的表达。

3 讨论

天疱疮属于自身免疫性皮肤病，以正常皮肤或黏膜上出现松弛性水疱为主要表现，尼氏征阳性，若不针对此类临床症状采取及时有效的措施，不但会造成皮肤损伤，还可能引起精神障碍、发热等全身性症状，严重影响天疱疮患者的日常生活水平和质量。在构建的天疱疮细胞模型中加入卡巴胆碱，桥粒蛋白染色模式和细胞解离发生逆转，证实卡巴胆碱对棘层松解有逆转作用，同时卡巴胆碱还可增加Dsg3 的荧光强度[8-10]。构建模型中的Dsg3 和PG 这两项指标的总蛋白量一直在下降，由此可知，蛋白总量和表达水平下降不存在联系，反而可能是蛋白内化降解导致。由本次研究实验可得，在构建模型中加入卡巴胆碱，模型中的各种变化都在逆转，可稳定桥粒结构；卡巴胆碱可抑制EGFR 磷酸化，但不会对p38MAPK 磷酸化产生影响，这说明较下游信号途径是卡巴胆碱的作用之处，进而抑制棘层松解。本次研究对天疱疮棘层松解的相关情况进行相关性的探究，依据研究结果可知，寻常型天疱疮组在细胞解离实验中显示细胞碎片数目为（46.58±2.01）；棘层松解相关信号分子磷酸化水平，Dsg3 和PG 间的相互作用和桥粒分子mRNA 水平的表达三项水平或相关作用效果均受卡巴胆碱的影响。

综上所述，天疱疮棘层松解选用胆碱能受体可呈现一定的逆转作用，相应逆转机制包括--加强PG 和Dsg3 的相互作用；抑制前两项指标的内化加强表达；抑制棘层松解EGFR的磷酸化。