非编码RNA 与冠状动脉支架内再狭窄的研究进展

徐超，楚天舒

（昆明医科大学第二附属医院心内科二病区，云南 昆明）

0 引言

冠心病严重威胁人类生命、健康，具有高死亡率和高致残率。我国冠心病患病率处于持续上升阶段，带来了沉重的社会及经济负担。据《中国心血管病报告2018（概要）》数据显示全国冠心病患者1100 万，2017 年冠状动脉经皮介入治疗数超过75 万例[1]。经皮冠状动脉介入治疗( percutaneous coronary intervention，PCI) 是冠状动脉血管重建治疗的转折点，显著改善冠心病患者预后，成为冠心病最有效的治疗手段。但 PCI 术后存在支架内再狭窄(instent restenosis，ISR) ，严重限制其临床疗效。据统计裸金属支架植入术后ISR 的临床发生率约为20%-35%，药物洗脱支架的使用使ISR 的发生率降低到5%-10%[2,3]，如何预防及治疗ISR 是当前心血管领域亟待解决的问题。血管损伤及修复、血管重塑是ISR的重要机制。基因在疾病的发生、发展过程中起到了重要的地位，研究表明非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）在血管损伤及修复、血管重塑等血管疾病的发生、发展过程中发挥表观遗传调控作用，本文对 ncRNA 与ISR 相关机制进行综述，ncRNA 的测定及靶向治疗可能为ISR 防治提供新的思路和策略。

1 概述

ISR 发生于冠状动脉粥样硬化患者冠状动脉成形术与支架植入术后，冠脉支架全程和/ 或两端5 mm 节段内管腔丢失，冠脉造影发现管腔狭窄≥50%，或血管内成像发现新出现的支架内管腔≥75% 的狭窄并伴见相对应的心肌缺血临床表现[4]。血管成形术或支架植入导致病变血管内皮细胞破坏、内部弹性纤维层断裂，支架作为外源性物质，通过促进炎症反应、免疫反应、血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和植入后新内膜的形成等引起ISR 和晚期血栓形成。在动物模型和患者中观察到再狭窄过程包括弹性回缩、血栓、新内膜的形成和的血管重塑[5]。血管机械拉伸导致内皮细胞（endothelial cells，ECs）剥脱，ECs、炎症细胞和血小板释放各种细胞因子促进新生内膜层血管VSMCs 和成纤维细胞发生迁移和增殖，导致内膜增生及血管重塑[6]。药物洗脱支架虽有效抑制VSMCs 的增殖和迁移，但抑制损伤血管内膜内皮化，内皮下胶原长时间暴露亦可导致晚期血栓形成[7]。可见VSMCs 和ECs 失衡在血管损伤及修复、血管重塑等血管疾病中起到关键作用，是导致ISR的重要机制。

目前研究表明，人类大约只有2% 的基因组负责编码蛋白质， ncRNA 来源于“非编码”基因组区域转录而来的异质类RNA 分子[8]。根据链的长短，主要分为小分子ncRNA(＜200bp)和 长 分 子ncRNA（＞200bp），前 者 包 括miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、snRNA（small nuclear RNA）、piRNA（piwi-interacting RNA）、tRNA（transfer RNA），后 者 包括rRNA（ribosomal RNA）、自然反义转录子、lncRNA（long noncoding RNA）[9]。大量研究表明ncRNA 是机体代谢、发育和分化等各种生理和生物学反应的重要介质，与机体的某些病理状态有关，ncRNA 在血管功能障碍、再内皮化和血管再狭窄中发挥重要作用，ISR 与ncRNA 的失调密切相关，本文主要集中讨论研究较多的三类ncRNA：miRNA、lncRNA、siRNA 基因表达中起调控作用与ISR 的关系。

2 miRNA 与ISR

目前对miRNA 的研究较为广泛，miRNA 由18-22 个核苷酸组成，在3’- 非翻译区(3'-UTRs) 与靶基因结合，导致信使RNA的直接降解或通过补体进行翻译抑制，从而能够调节基因的表达[10]，大量miRNA 被确认为多种疾病中基因表达的重要转录后调控因子，可作为心血管疾病的生物标志物[11]。在ISR 的发生、发展中，miRNA 对VSMCs 及ECs 功能调节上具有关键性作用。

Ji 等[12]首次利用miRNA 阵列测定大鼠球囊损伤后颈动脉miRNA 谱，在新生内膜病变中测定到miR-21 的异常过表达，miR-21 通过直接靶向作用于磷酸酶和Tensin 同源蛋白促进VSMCs 的增殖，后者是VSMCs 体内和体外功能的关键调控因子。血管造影证实的ISR 患者体内miR-21 循环水平明显高于对照组，支持了miR-21 的调节在人类临床中具有相关性的观点[13]。Wang 等[14]人使用anti-miR-21 涂层支架测试局部递送miR-21抑制剂对损伤动脉的影响，证明anti-miR-21 涂层支架在不影响再内皮化的情况下显著减少支架内再狭窄。miR-143 和miR-145被认为是血管发育和血管疾病中VSMCs 表型开关的主要调控因子[15]，miR-145 和miR-143 基因组消融可导致小鼠VSMCs 分化不完全，在控制VSMCs 足突形成中发挥作用[16]。临床证据显示，miR-143 循环水平能够预测ISR 发生，miR-143/miR-145 强烈参与新生内膜形成的分子机制[13]。研究发现miR-22 在受损股动脉中下调，通过靶向结合甲基蛋白、组蛋白去乙酰化酶和回归病毒整合位点蛋白同源物的3'UTR，过表达可降低VSMCs 的增殖，抑制损伤股动脉的新生内膜形成[17]。在大鼠模型中，观察到球囊损伤颈动脉组miR-133 水平降低[18]，miR-133 表达降低VSMCs 的增殖和迁移，腺病毒介导的miR-133 过表达可减弱球囊损伤后的新生内膜形成，而抑制其内源性水平则可诱导相反的效果，冠状动脉miR-133a 浓度梯度的降低预示着ISR 率更高[19]。miR-195 表达限制VSMCs 增殖、迁移，在周围动脉疾病患者支架植入术2 年后，miR-195 循环水平是靶血管重建的独立预测因子[20]。miR-9、miR-23b、miR-559 和miR-663 介导抑制血管增生疾病进的一步例子，此外，miR-125b、miR-130a、miR-146a、miR-210 等其他miRNA 也参与调控VSMC 功能[21]。特别是miR-21、miR-100、miR-143 和miR-145 的循环水平与药物支架植入后ISR 的发生有关，在ISR 患者循环中，miR-21 水平随着miR-100、miR-143和miR-145 水平的降低而显著升高。

ECs 具有维持血管正常生理功能、调节血管对剪切应力变化的反应重要作用，血管破裂区域的不完全覆盖是动脉粥样硬化和晚期血栓形成的主要原因，支架置入后腔内ECs 的快速再生可预防ISR 和血栓形成[22]。miRNA 对ECs 具有潜在的调控作用。ECs 表达中miR-126 量最高，它参与炎症反应和内皮功能的调节[23]。在小鼠模型中，miR-126 缺失使受损动脉ECs 再生障碍，导致血管完整性丧失和血管生成减少[24]。动脉粥样硬化的早期阶段炎症细胞因子高表达，miR- 126 具有调节血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子功能，主要信号通路包括通过抑制SPRED-1（出芽相关蛋白sprout-related protein）和PIK3R2（2 磷酸肌醇3 激 酶 调 节 亚 基2phosphoinositol-3 nase regulatory subunit）、以及 VCAM-1（血管细胞粘附蛋白1Vascular cell adhesion molecule 1）高表达[23,25]。miR-126 通过调节ECs 对脂质的反应改变ECs的转化率发挥保护作用[26]，过表达促进ECs 增殖来预防动脉粥样硬化。miR-17/92a 被认为是另一个关键调控因子，在冠状动脉搭桥手术患者、缺血和血管损伤的动物模型中，其水平均升高[27]。miR-221/222 在体外抑制ECs 增殖和迁移，抑制新生血管形成[28]。最近研究表明miR-222 通过内皮衍生的微颗粒传递，远程调节细胞内粘附分子的表达，参与细胞间信号转导[29]。

综上所述，不同的miRNA 在调解VSMCs、ECs 功能相关的分子和通路中起到表观调控作用，可以作为ISR 的重要早期标志物，对miRNA 的调控可能对ISR 具有治疗潜力。

3 lncRNA 与ISR

近年来lncRNA 的生物学功能引起了人们的广泛关注。 LncRNA 是一大类由RNA 聚合酶II 转录、异构级不同的RNA 分子，链长大于200 个核苷酸。lncRNA 对基因调控的各个方面都有重要作用，如染色质重构、RNA 转录、选择性剪接等[30]。由于lncRNA 具有与DNA、RNA 和蛋白质靶点相互作用的能力，在细胞增殖、迁移、凋亡、分化和发育中发挥关键作用。lncRNA 功能和表达的改变可以导致多种人类病理过程，越来越多的证据表明lncRNA 在血管重构等疾病中起到关键性的作用。

最早的研究发现lncRNA 在大鼠模型中通过介导Ang II 信号通路导致表达显著改变，在VSMCs 增殖和内膜病变发展中起到重要作用[31]。lncR ANRIL 的下调可增强CDKN2A/B（细胞周期依赖性激酶抑制基因）的表达，抑制VSMCs 增殖，该基因位点与以血管形成改变或重构为特征的疾病相关[32]。Tang 等[33]发现VSMC 分化期lncR Gas5 作用于TGF-β/ Smad3（transforming growth factor β1，TGF-β1）信号通路，抑制Gas5 表达导致VSMC分化下调。lncR-p21 的下调p53 的活性抑制VSMCs 增殖[34]；lncR MEG3 可影响VSMCs 生存和迁移[35]；LncR-AK098656 表达上调细胞外基质蛋白、降低了收缩蛋白水平、促进VSMCs 的增殖和迁移，AK098656 转基因大鼠出现自发性高血压、VSMCs 合成表达升高、动脉狭窄[36]；lncR-RNCR3 在小鼠和人类主动脉粥样硬化病变中上调，RNCR3 的下调降低了ECs 和VSMCs 在体外的增殖、迁移，加速了细胞凋亡的发生，RNCR3 具有动脉粥样硬化保护作用，可用于动脉粥样硬化相关血管疾病的治疗[37]。

此外，研究发现LncR ATG9B 在ECs 表达中富集，ATG9B 是一种反义lncRNA，与内皮型一氧化氮合酶（NOS3 或eNOS）基因部分重叠，在正常情况下ECs 中的表达较低，在缺氧后表达上调，ATG9B 能够下调eNOS 的表达减少一氧化氮的生成，一氧化氮具有抗动脉粥样硬化和抗血栓形成的特性[38]。另一类个反义lncR HIF-1AS 在不同的人体组织中表达，在急性心肌梗死患者中表达上调，HIF1A-AS1 促进ECs 增殖和减少凋亡[39]。LncRNA MALAT1 在内皮细胞中高度表达，与内皮细胞功能、炎症过程和血管生成密切相关[40]。同时发现lncRNA 与miRNA 之间的相互作用调节ECs 功能，LncRNA-p21 通过调控mirna - 13038 促进ECs的增殖和抑制细胞凋亡[41]。

总之，随着研究进展不断深入，lncRNA 在调控VSMCs 的表型、ECs 的增殖与凋亡等功能逐渐被人们知晓，lncRNA 在ISR 生物学机制中起到关键作用，为ISR 靶点治疗提供新的希望。

4 siRNA

siRNA 是一类长度为20-25 个核苷酸的双链RNA，通过与mRNA 结合并促进其降解来抑制特定mRNA 的翻译。虽然内源性siRNAs 在极少数哺乳动物中被发现，但它们可以通过多种转染途径被导入动物的细胞中，并能有效地产生靶向基因的特异性敲除。因此，siRNA 是研究基因功能和药物靶点的重要工具。近年来，它也被认为是治疗再狭窄的治疗策略之一。

整合素在细胞黏附和迁移中起着重要作用，Kindlin-2 是整合素聚集和激活的关键成分，因此，可以通过调节整合素来抑制VSMC 的活化和迁移[42]。Wnt 信号通路在VSMC 的细胞增殖、迁移、粘附和存活过程中起着不可或缺的作用[43]。利用siRNA 抑制Kindlin-2 可以阻断Wnt 信号，抑制VSMC 的增殖和迁移[44]。间质相互作用分子1 (STIM1)促进生长因子诱导的VSMCs 增殖，而siRNA 抑制STIM1 可减弱冠状动脉平滑肌细胞（HCASMC）增殖。此外，在颈动脉成形术动物模型中，特异性RNA 干扰沉默STIM1也可抑制再狭窄[45]。虽然这些结果还没有在临床实验中得到证实，但为siRNA 预防支架植入后再狭窄提供了新方向。

5 ncRNA 在ISR 中临床展望

近年来，ncRNA 从实验室到临床的转化备受关注，在动物实验或临床试验中，预防血管细胞增殖、内膜增生和ISR 方面表现出较好的效果，具有很大的应用潜力。随着ncRNA 检测、分析方法的不断改进，新技术的开发应用，在将来可以实现无标签、可靠、廉价和快速的检测方法，进一步推动临床研究，循环ncRNA 作为诊断性生物标志物。尤其是ncRNA 作为临床生物标志物具有特殊的优势：能够反映了细胞内生物过程的状态，对跟踪某一疾病背后的特定生物学过程或对某一特定疾病、临床综合征的病因诊断、治疗和预后有明显影响。在支架植入前，可通过ncRNA 对ISR 风险进行预测，判断患者ISR 的风险高低，为选择更为精准的治疗方案提供可靠指导。

同时，为克服药物洗脱支架ISR 限制，提出基因洗脱支架设想，该支架不仅可以传递抗炎、抗血栓药物，还可以携带miRNA、siRNA 等ncRNA。通过使用覆盖ncRNAs 的支架控制易感区域基因的表达来限制ISR 的形成和发展，从而达到更好的预防、治疗作用。为证明这一观点，Akt1 siRNA 涂层支架的第一阶段临床试验已被证明对ISR 有效，通过AKT1 siRNA 持续释放到支架附近的位置，从而抑制VSMCs 的增殖并防止再狭窄[46]。ncRNA 洗脱涂层支架可能是避免植入后心血管损伤患者再狭窄的最有效策略。尽管ncRNA 在动物模型和临床试验中显示出潜在的益处，但关于ncRNA 在血管重构机制中所起作用的实验证据是最近才积累起来的，ncRNA 生物学机制尚未完全清楚、是否会带来基因副作用等问题需要进一步探索，此外，人类对心血管疾病的认识很有限，因此，在心血管疾病患者中植入ncRNA 支架仍有很长的路要走。