高效液相色谱-二极管阵列检测器检测人血浆中美罗培南的浓度

陈玲 楼江 史长城 严伟 李晴宇 林能明

美罗培南属碳青霉烯类抗菌药物，对产超广谱β-内酰胺酶和质粒介导产头孢菌素酶的革兰阴性杆菌和部分革兰阳性杆菌具有良好的治疗效果，对腹腔、皮肤、尿路和脑膜等部位感染治疗均有效[1-2]。美罗培南属时间依赖型抗菌药物，抗菌效果取决于血浆药物浓度高于病原菌最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）的保持时间。占总治疗时间的40%以上时能产生最大抗菌效应；推荐对使用美罗培南的患者进行血药浓度监测，部分重症患者使用美罗培南可能达不到有效血药浓度，从而导致治疗失败或耐药细菌产生[3-4]。重症感染、年龄、感染部位和生理状态等可能影响美罗培南的药效动力学参数，监测美罗培南血药浓度，及时调整给药方案具有重要的临床意义[5-8]。本研究以雷尼替丁为内标，采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）检测人血浆中美罗培南的浓度，观察该检测方法的效果，以期为临床指导美罗培南血药浓度测定和合理用药提供参考，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱系统包括四元泵（型号：G1311B）、柱温箱（型号：G1311B）、自动进样器（型号：G1329B）和DAD检测器（型号：G1315D）均为安捷伦科技有限公司产品，低速离心机（型号：DM0412S）、高速离心机（型号：D3024）和涡旋混合器（型号：MX-S）为美国赛洛捷克公司产品，超纯水仪（型号：Thermo fisher LabTower ED1）为美国赛默飞世尔科技公司产品。

1.2 药品和试剂 美罗培南（中国食品药品检定研究院，纯度 99.9%，批号：130506-201403，100 mg），雷尼替丁（中国食品药品检定研究院，纯度99.9%，批号：1001163-201607，100 mg），甲醇和乙腈（色谱级，德国默克公司），磷酸二氢钾（分析纯，上海泰坦化学有限公司），空白血浆为人体血浆，来自本院输血科。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 分析柱是Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.6 μm），柱温 30 ℃；流动相为25mmol/L KH2PO4-乙腈（92∶8，V/V，pH5.0），流速 0.8 ml/min，进样量50 μl，检测波长和参比波长分别是308、380 nm。

1.3.2 溶液配置 美罗培南标准液配制：精密称取20.62 mg的美罗培南标准品，加双蒸水溶解并稀释定容至 10 ml，得 2 062.0 μg/ml的标准液，放置于-80 ℃冰箱中保存备用。雷尼替丁标准液配制：精密称取17.74 mg的雷尼替丁标准品，加双蒸水溶解并定容至10 ml，得1 774.0 μg/ml的标准液，放置于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.3 样品处理 精密吸取200 μl血浆放入1.5 ml离心管中，加入内标50 μl（雷尼替丁浓度为44.35 μg/ml），再加入400 μl甲醇，涡旋震荡2 min混匀，在4℃下12 000 r/min进行高速离心5 min，取上清液200 μl加入300 μl双蒸水，涡旋震荡1 min混匀，再次4℃下12 000 r/min高速离心5 min，吸取上清液50 μl进样。

1.4 方法学验证 依据《中国药典2015版（第4部）》中的《生物样品定量分析方法验证指导原则》[9]对本研究方法专属性、标准曲线、精密度、回收率和被测物稳定性进行观察。

1.4.1 专属性 取6份不同来源的未服用美罗培南和雷尼替丁的空白血浆，按“1.3.3”方法处理后进样，观察本研究方法是否有内外源性物质干扰，观察其专属性。

1.4.2 标准曲线 取美罗培南标准液用双蒸水逐级稀 释得 5.15、10.3、20.6、51.5、103.0、206.0、515.0 和1 031.0 μg/ml的标准液，上述标准液用空白血浆稀释10 倍，得到标准曲线浓度分别是 0.515、1.03、2.06、5.15、10.30、20.60、51.50 和 103.1 μg/ml，按“1.3.3”方法处理后进样，测得美罗培南和内标峰面积，以美罗培南浓度为横坐标（x），美罗培南和内标峰面积之比为纵坐标（y），考察标准曲线的线性相关性。

1.4.3 回收率和精密度 最低定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ）是标准曲线的最低点，是能够满足可靠定量样品中分析物的最低浓度，LLOQ应满足信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）≥10。取美罗培南储备液逐渐稀释后得 5.15、20.6、206.0 和 825.0 μg/ml的标准液，用空白血浆稀释10倍，得LLOQ和低、中、高浓度的质控（quality control，QC）样品，浓度分别是 0.515、2.06、20.6 和 82.5 μg/ml，按“1.3.3”方法处理后进样，每个浓度平行处理5份，计算日内精密度和回收率，QC样品连续3 d处理进样，计算日间精密度。根据《生物样品定量分析方法验证指导原则》[9]，LLOQ的回收率在80%～120%，精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤20%，QC的回收率应在 85%～115%，精密度的 RSD≤15%[9]。

1.4.4 稳定性试验 （1）短期放置稳定性：将美罗培南QC 血浆放置于室温保存 1、2、4和 8h，按“1.3.3”方法处理后进样，平行处理3份，比较实测值与理论值的偏差，在±15%内表示稳定。（2）自动进样器放置稳定性：将QC血浆按“1.3.3”方法处理，平行处理3份，置于20℃的自动进样器中1、2、4和8 h进样，比较实测值与理论值的偏差，在±15%内表示稳定。（3）长期放置稳定性：①冻存稳定性：将QC血浆放置于-80℃冰箱中20、40和60 d，按“1.3.3”方法处理后进样，平行处理3份，比较实测值与理论值的偏差，85%～115%之间表示稳定。②冻融稳定性：将QC血浆放置-80℃冰箱冻保，室温下溶解，反复冻融1、2和3次（每次冻融时间间隔超过12 h），按“1.3.3”方法处理后进样，平行处理3份，比较实测值与理论值的偏差，在±15%内表示稳定。③储备液稳定性：将美罗培南和雷尼替丁储备液（第0天）用双蒸水分别稀释至10 μg/ml后直接进样，将上述标准液放置-80℃冰箱中20、40和60 d后直接进样分析，平行测定3次，比较放置后美罗培南和雷尼替丁峰面积与第0天测定峰面积的偏差，在±15%内表示稳定。

2 结果

2.1 专属性 本研究条件下美罗培南和雷尼替丁的分离效果良好，保留时间分别是3.34、4.68 min，空白血浆不存在内外源性干扰物质，见图1，本方法专属性较高。

2.2 标准曲线 美罗培南在0.515～103.1 μg/ml范围内的线性关系良好，y=0.0328x+0.00006，相关系数r=0.99972。

2.3 回收率和精密度 美罗培南LLOQ的回收率和精密度RSD分别是98.76%和1.67%，低、中和高浓度QC回收率在94.21%～107.61%，日内和日间精密度的RSD均＜4%，表明美罗培南在该方法下回收率和精密度较好，见表1。

2.4 稳定性试验 短期稳定性方面，美罗培南在室温放置8 h稳定，QC的准确度为91.04%～95.15%。自动进样器放置稳定性方面，美罗培南的血浆处理液在自动进样器放置8 h内稳定，QC的准确度为90.78%～93.78%。长期稳定性方面，美罗培南在-80℃冻存放置60 d内稳定，准确度96.55%～98.06%。美罗培南在-80℃和室温下反复冻融3次也稳定，准确度96.91%～100.34%，见表2。储备液稳定性方面，美罗培南和雷尼替丁储备液在-80℃条件下存储60 d稳定，准确度分别是95.82%～99.33%和96.40%～103.16%，见表3。

2.5 临床应用 用已建立的方法对5例使用美罗培南的重症感染患者进行稳态谷浓度测定，发现其血药浓度个体差异大，见表4。

3 讨论

图1 高效液相色谱图（a为空白血浆；b为美罗培南和雷尼替丁标准液；c为空白血浆中加美罗培南（0.515 μg/ml）和雷尼替丁；d为临床样本）

表1 美罗培南的回收率和精密度

表2 美罗培南在各种条件下的稳定性实验

表3 美罗培南和雷尼替丁储备液的稳定性

表4 患者基本情况及美罗培南治疗药物监测结果

3.1 内标的选择 多数研究美罗培南测定方法的内标是甲硝唑或头孢吡肟等抗菌药物，或降压药氢氯噻嗪，但他们可能对测定结果有干扰[10-13]。本研究使用H2受体阻滞剂雷尼替丁作为内标，与头孢类药物相比，本品稳定性更好，长期放置不易分解，现临床也较少使用本品抑制胃酸分泌。与氢氯噻嗪相比，雷尼替丁干扰测定结果的概率较小，因此更适合做美罗培南血浆浓度测定的内标。

3.2 前处理的选择 美罗培南的前处理方法有固相萃取和蛋白沉淀，固相萃取耗时且昂贵，本研究选用更简单的蛋白沉淀法[12，14]。研究初期尝试使用甲醇蛋白沉淀后的上清液直接进样，发现对美罗培南和内标物的色谱峰形有较大影响，可能与美罗培南和雷尼替丁的水溶性强，直接进样因溶剂效应导致色谱峰不对称。有研究使用二氯甲烷稀释蛋白沉淀液进样，二氯甲烷毒性大且易挥发，需要放置通风厨中操作，同时对人体和环境也有一定危害[15]。本研究使用不同比例的双蒸水对甲醇沉淀液进行稀释（甲醇沉淀液：水比例为 1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2和 1∶3），发现 1∶1.5 的比例既能满足 LLOQ 的测定，色谱峰形也对称。

3.3 检测波长的选择 紫外检测器的检测波长和被测物质吸收有关，美罗培南的检测波长大多介于296～304 nm[15-16]。与文献报道类似[17]，本研究使用DAD检测器对美罗培南和内标进行全紫外波长扫描（190～440 nm，步进值2 nm）。发现美罗培南和雷尼替丁在300～310 nm区域信号响应较大，但空白血浆在300～304 nm波长时，美罗培南和雷尼替丁之间存在内源性杂质，但该杂质在308 nm处无紫外波吸收，为了不影响美罗培南定量和响应，将308 nm作为本研究检测波长，为最大程度消除仪器基线噪音干扰，将380 nm作为本研究参比波长。

3.4 LLOQ的选择 美罗培南是时间依赖型抗菌药物，抗菌效果取决于血浆药物浓度高于病原菌MIC的保持时间。为满足美罗培南血药浓度监测的临床需求，LLOQ应接近欧洲抗菌药物敏感判断标准对美罗培南敏感菌株的MIC[18]。本院对美罗培南敏感菌株的MIC接近 1.0 μg/ml，本研究 LLOQ 是 0.5 μg/ml，能满足美罗培南的定量标准。

综上所述，本研究建立了灵敏、快速和高效的人血浆中美罗培南的HPLC-DAD检测方法，能够满足美罗培南在人血浆的药物监测工作，具有一定的实用价值。