乳腺癌组织 miR-23a、miR-1247-5p表达与临床病理特征及预后的关系

郭斌 于桑桑 顾蓓

恶性肿瘤是威胁人类健康的第一杀手，已成为全球性的公共卫生问题，每年约有700万人死于恶性肿瘤；据统计，2018年全球约有210万女性乳腺癌新发病例，约占女性恶性肿瘤新发病例的25%[1]。目前，手术切除是乳腺癌治疗的最有效治疗手段之一，寻找有效的评估患者术后预后的生物靶标是乳腺癌研究领域的热点之一。微小RNA（microRNA，miR）在调节肿瘤细胞增殖、分化、血管生成、侵袭、化疗耐药等过程中具有重要作用。目前已发现，乳腺癌细胞中存在多种异常表达的miR发挥调节功能，如miR-424抑制乳腺癌细胞增殖[2]，miR-1297促进乳腺癌细胞侵袭[3]。朱丽华等[4]研究发现miR-23a检测有助于胃癌诊断、预后判断，Eissa等[5]证实miR-23a在乳腺癌中发挥促癌基因作用，并可通过直接激活癌基因叉头蛋白M1（forkhead box M1，FOXM1）和富组氨酸糖蛋白（histidine rich glyco,HRG）基因表达，诱导乳腺癌恶性进展。miR-1247-5p是近年来新发现的miR，其在肝细胞癌中发挥抑癌基因功能[6]，而miR-1247-5p在乳腺癌的相关研究甚少。鉴于此，本研究通过检测乳腺癌组织中miR-23a、miR-1247-5p的表达水平，探讨其表达与患者临床病理特征、术后预后的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2012年1月至2013年12月在昆山市第二人民医院行乳腺切除手术的150例乳腺癌患者为研究对象，均为女性，年龄 26～73（54.36±9.78）岁。纳入标准：（1）具有完整的病历资料和随访资料；（2）术前未经抗肿瘤治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）合并糖尿病等慢性疾病；（3）合并血液系统疾病或免疫系统疾病。收集患者手术切除的乳腺癌组织及配对的癌旁正常组织样本用于miR-23a、miR-1247-5p表达水平检测。

1.2 方法 采用实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）法检测乳腺癌组织与癌旁正常组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平。取50～100 mg组织样本、1 ml Trizol试剂，加入至电动匀浆器，匀浆约2 min，转移匀浆液至EP管中，依次加入氯仿、异丙醇、乙醇，抽提组织样本总RNA，RNase-free ddH2O溶解后，测定RNA纯度及浓度后，逆转录为cDNA，-20℃冰箱中保存备用。参照SYBR Premix EX TaqTM试剂盒（大连生物工程有限公司）说明书，配制RT-PCR反应体系，miR-23a、miR-1247-5p和U6引物（上海生工生物工程有限公司）序列如下：miR-23a正向引物为5′-GGG GAT CAC ATT GCC AGG-3′，反向引物为 5′-AGT GCG TGT CGT GGA GTC-3′；miR-1247-5p 正向引物为 5′-ACA CTC CAG CTG GGA CCC GTC CCG TTC GTC C-3′，反向引物为 5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC G-3′；U6 正向引物为 5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC TAA AAT-3′，反向引物为 5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。RTPCR反应条件如下，预变性：95℃，10 min；40个循环：95 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，30 s。实验结果以循环数（cycle threshold，Ct）值表示，U6 为内参，采用 2-ΔΔCt公式计算miR-23a、miR-1247-5p相对表达水平。

1.3 观察指标 （1）比较乳腺癌组织与癌旁正常组织miR-23a、miR-1247-5p 表达水平；（2）分析乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平与患者临床病理特征、预后的关系，及对患者预后的预测价值。

1.4 统计学处理 采用SPSS20.0统计软件。计量资料以 表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用两独立样本t检验。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，两组患者生存曲线的比较采用log-rank检验。采用ROC曲线分析miR-23a、miR-1247-5p对乳腺癌患者预后的预测价值。P＜0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁正常组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平比较 乳腺癌组织miR-23a表达水平高于癌旁正常组织，miR-1247-5p表达水平低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

2.2 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平与患者临床病理特征的关系分析 乳腺癌组织miR-23a表达水平与患者年龄、绝经状态、肿瘤部位、组织病理分级无关（均P＞0.05），与肿瘤直径、分子分型、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05）。乳腺癌组织miR-1247-5p表达水平与患者年龄、绝经状态、肿瘤部位、肿瘤直径无关（均P＞0.05），与组织病理分级、分子分型、淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.05），见表2。

表1 乳腺癌组织与癌旁正常组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平比较

2.3 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平与患者预后的关系分析 以乳腺癌组织miR-23a表达水平的中位数（1.58）为界，将乳腺癌患者分为miR-23a高表达组（74例）和miR-23a低表达组（76例）。生存曲线分析显示，miR-23a低表达组患者的术后5年生存率为72.97%（54/74）、中位生存时间53.85个月，均分别高于miR-23a高表达组患者的46.05%（35/76）、42.58个月，差异有统计学意义（log-rank χ2=13.302，P＜0.05）。以乳腺癌组织中miR-1247-5p表达水平的中位数（0.42）为界，将乳腺癌患者分为miR-1247-5p低表达组（76例）和miR-1247-5p高表达组（74例）。生存曲线分析显示，miR-1247-5p高表达组患者术后5年生存率73.68%（56/76）、中位生存时间52.54个月，均分别高于miR-1247-5p低表达组患者的44.59%（33/74）、43.62个月，差异有统计学意义（log-rank χ2=12.650，P＜0.05）。乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平与患者预后的生存曲线见图1。

2.4 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平对患者预后的预测价值分析 以术后5年存活的患者为阳性样本（89例），以术后5年死亡的患者为阴性样本（61例），建立ROC诊断分析模型。结果显示：检测miR-23a、miR-1247-5p对乳腺癌患者预后预测的AUC分别为 0.709（95%CI：0.625～0.793）、0.690（95%CI：0.606～0.775），灵敏度分别为 0.812、0.749，特异度分别为 0.637、0.622，见图 2、表 3。

表2 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平与患者临床病理特征的关系分析

图1 不同乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平患者生存曲线比较

图2 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p对患者预后预测价值的ROC曲线

表3 乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p对患者预后预测价值的ROC分析结果

3 讨论

乳腺癌是源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，原位乳腺癌患者经手术治疗后的预后良好，但突破乳腺基底膜并伴有淋巴结转移或远处转移的乳腺癌患者，经手术治疗后的预后情况难以预估。寻找有效的评估乳腺癌患者术后预后的生物学靶标成为乳腺癌研究领域的热点之一。大量研究证实，淋巴结转移、远处转移、TNM分期、病理分级及分子分型等均与乳腺癌患者术后预后有关[7-8]，但上述指标对患者无法进行个体化地预测、评估预后。近年来分子生物学发展迅猛，大量miR分子被证实在预测、评估恶性肿瘤患者预后中具有靶分子的潜能。研究表明，miR-23a在不同的恶性肿瘤中的表达情况不一致，如在骨肉瘤[9]、恶性胶质瘤[10]中表达降低，而在非小细胞肺癌[11]、结直肠癌[12]中表达增加，表明miR-23a同时具有抑癌和促癌基因功能。

本研究RT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织中miR-23a表达水平增加，提示miR-23a可能在乳腺癌变过程中发挥促癌基因作用；Chen等[13]发现Lumina乳腺癌细胞中，miR-23a调节X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）介导的细胞自噬过程，促进细胞存活和侵袭。Ma等[14]证实miR-23a通过直接靶向调节CDH1基因表达和激活Wnt/βcatenin信号通路，促进乳腺癌细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1） 诱导的上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transitions，EMT）和肿瘤侵袭过程，本研究发现miR-23a表达与乳腺癌的肿瘤直径、分子分型、淋巴结转移、TNM分期有关，表明miR-23a可能在乳腺癌细胞增殖、雌激素受体/孕激素受体/人类表皮生长因子受体2分子表达、EMT等病理过程发挥作用。

有研究表明，miR-1247-5p在皮肤鳞状细胞癌增殖、侵袭过程中发挥抑癌基因作用[15]，而miR-1247-5p在去势耐药前列腺癌中表达增加，发挥促癌基因功能[16]。本研究发现miR-1247-5p表达降低，且其表达与组织病理分级、分子分型、淋巴结转移、TNM分期有关，初步表明miR-1247-5p在乳腺癌中发挥抑癌基因作用，且可能参与乳腺癌细胞分化、增殖及转移等过程。Zhang等[17]研究结果表明，乳腺癌中miR-1247-5p低表达与较高TNM分期、淋巴结转移、不良病理分化和分子分型有关，且被证实可能是通过DVL1/Wnt/β-catenin信号通路调节肿瘤细胞增殖[18]，与本研究结论一致。

本研究生存曲线分析显示，与miR-23a低表达、miR-1247-5p高表达患者相比，miR-23a高表达、miR-1247-5p低表达患者的术后预后较差。Zeng等[18]发现miR-1247-5p低表达与乳腺癌患者不良预后有关，Ahmad 等[19]发现 miR-23a～27a～24-2 基因簇与乳腺癌患者预后有关。此外，ROC曲线分析显示，乳腺癌组织miR-23a、miR-1247-5p表达水平对患者预后预测的灵敏度、特异度均较高，提示miR-23a、miR-1247-5p表达水平检测在乳腺癌预后判断中具有较好的临床应用价值。

综上所述，乳腺癌组织miR-23a表达上调，miR-1247-5p表达下调，且均可能在乳腺癌细胞的增殖、分化、侵袭等过程中发挥调节功能，检测该两指标有助于预测患者术后预后。