基于广义估计方程探讨剖宫产史对体外受精-胚胎移植患者妊娠结局的影响

金碧辉 张岭 傅晓华 朱晶 吴香丽 舒静

由于各种原因，国内剖宫产率高达28.8%～34.9%，远超WHO所推荐的10%～15%[1]。随着二孩政策的开放，剖宫产对女性远期生殖健康及再次妊娠的影响越来越受到关注。研究发现，剖宫产史除了可引起子宫瘢痕妊娠、凶险性前置胎盘、妊娠期子宫破裂、产后大出血等严重并发症外，还可以通过导致不孕症直接降低女性再生育能力[2]。因此，与仅有经阴道分娩史的妇女相比，既往有剖宫产史的妇女可能更多地需要通过辅助生殖技术来达到再生育的目的。因此，研究辅助生殖技术对于既往不同分娩方式妇女的助孕结局是否存在差异具有重要意义。然而，近年来关于这个话题的研究结论尚存在很大争议[3-5]。本研究回顾性分析了既往不同分娩方式患者首个取卵周期所得胚胎新鲜或冻融胚胎移植的妊娠结局，探讨剖宫产史对于体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 选取有过1次孕28周以上分娩史，并因继发不孕于2016年1月至2019年4月在本院行体外受精-胚胎移植助孕的患者342例。纳入标准：（1）于本院进行的首个体外受精周期，所获得的有效胚胎至少进行1个周期新鲜或冻融胚胎移植；（2）女方取卵周期年龄≤43周岁，移植周期年龄≤45周岁。排除标准：（1）不止1次分娩史；（2）既往曾行子宫肌瘤或子宫腺肌瘤剔除术；（3）未经纠正的子宫腔畸形（如纵隔子宫）、宫腔占位性病变（如黏膜下子宫肌瘤、宫腔粘连、子宫内膜息肉）；（4）夫妻任何一方确诊染色体核型异常；（5）既往2次或2次以上难免流产史或反复种植失败史；（6）同一周期中移植来自两个不同取卵周期的胚胎。根据既往分娩方式分为剖宫产（caesarean section，CS）组和经阴道分娩（vaginal delivery，VD）组。两组患者年龄、不孕年限、BMI、基础卵泡刺激素（basal follicle stimulating hormone，bFSH）、不孕因素等基线资料比较差异均无统计学意义（均P＜0.05），见表1。本研究终点为患者成功分娩，或本周期所有胚胎移植完毕。经电子病历提取患者的基本情况及治疗资料，经双人核对、录入。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 根据患者的个体情况灵活选择促排卵方案、药物及启动剂量。常用促排卵方案包括拮抗剂方案、黄体期长方案、卵泡期改良长方案、超长方案、高孕激素下促排卵方案、克罗米芬微刺激方案等。常用促排卵药物包括重组人促卵泡激素（商品名：果纳芬，瑞士默克雪兰诺公司；商品名：普利康，美国默沙东公司）；尿促性素（商品名：乐宝得，珠海丽珠公司；商品名：贺美奇，德国辉凌制药公司）；甲羟孕酮（商品名：安宫黄体酮，仙琚制药公司）；克罗米芬（商品名：法地兰，塞浦路斯高特制药有限公司）；促性腺激素释放激素拮抗剂（商品名：思则凯，德国默克公司；商品名：加尼瑞克，美国默沙东公司）。经阴道超声监测卵泡生长情况及血清激素水平并适时调整用药，当至少1枚卵泡直径＞18 mm或2枚卵泡直径＞17 mm或3枚卵泡＞16 mm时行扳机。扳机方案：（1）重组人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）250 μg（商品名：艾泽，瑞士默克雪兰诺公司）；（2）促性腺激素释放激素激动剂（gonadotrophin-releasing hormone agonist，GnRHa）0.2 mg（商品名：达必佳，德国辉凌制药公司）；（3）双扳机：Gn-RHa 0.2 mg+hCG 2 000 U（商品名：注射用绒促性素，珠海丽珠公司）。扳机后34～36 h行经阴道超声引导下取卵术。

表1 两组患者基线资料比较

1.2.2 体外受精-胚胎移植及黄体支持方案 根据精液情况决定常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵母细胞胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。卵裂球胚胎分级标准如下。（1）Ⅰ级胚胎：卵裂球大小均匀，无碎片或仅有极少（10%）碎片；（2）Ⅱ级胚胎：卵裂球大小略不均匀，碎片率为10%～20%；（3）Ⅲ级胚胎：卵裂球大小明显不均匀，碎片率21%～50%；（4）Ⅳ级胚胎：卵裂球大小明显不均匀，碎片率≥50%。优质卵裂期胚胎定义为第3天6细胞以上的Ⅰ、Ⅱ级胚胎，可利用卵裂期胚胎定义为第3天4细胞以上的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎。胚胎常规培养至第3天，如有以下情况则考虑全胚冷冻：（1）移植日超声检查提示宫腔积液或子宫内膜回声异常；（2）移植日子宫内膜厚度＜7 mm或＞16 mm；（3）卵巢过度刺激高风险；（4）促排卵方案对子宫内膜容受性存有潜在影响，如高孕激素下促排卵方案、克罗米芬微刺激方案等；（5）患者伴有发热、阴道炎、急性盆腔炎等急性炎症期，或合并其他不宜行胚胎移植术的系统性疾病；（6）患者要求全胚冷冻。除此以外行新鲜胚胎移植。剩余胚胎如为优质胚胎可直接冷冻，非优质胚胎继续培养至第5或第6天形成囊胚后冷冻。囊胚评级参考Gardner评分系统，受精后第5或6天观察为3期及以上、内细胞团及滋养层细胞均为B级及以上者定义为优质囊胚，3期以上内细胞团及滋养层评分不同时为C者定义为可利用囊胚。所有胚胎移植术均在超声引导下进行，由经过严格训练能熟练操作的高年资医师完成，常规记录移植管规格、移植管内芯深度、置管次数，移植后显微镜下检视是否有胚胎残留，移植管是否染血。使用硬芯移植管和/或移植管染血者视为困难移植。新鲜周期黄体支持：黄体酮针剂（浙江仙琚药业，20 mg/支）40 mg肌肉注射1次/d+地屈孕酮片（商品名：达芙通，美国雅培公司，10 mg/片）10 mg口服2次/d。冻融周期黄体支持：自然周期同新鲜周期，激素替代周期采用戊酸雌二醇片（商品名：补佳乐，德国拜耳公司，1 mg/片）3 mg口服2次/d+黄体酮针剂40 mg肌肉注射1次/d+地屈孕酮片10 mg口服3次/d+黄体酮软胶囊（商品名：安琪坦，法国博赏公司，100 mg/片）200 mg纳入阴道3次/d。

1.3 妊娠结局指标 主要结局指标：活产率。次要结局指标：hCG阳性率、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率、异位妊娠率。

1.4 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料以 M（P25，P75）表示，两组比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。采用广义估计方程（generalized estimated equations,GEE）评估两组妊娠结局的差异，在GEE模型中采用Binary logistic作为连接函数进行分析，同时在GEE模型中进一步校正其他混杂因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者体外受精与胚胎移植周期特征比较 两组患者首个取卵周期中所用促性腺激素（gonadotropin,Gn）剂量（包括重组人促卵泡激素和尿促性素）、促排天数及扳机日雌二醇水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），获卵数、ICSI比例、正常受精率、可利用胚胎率及优胚率比较差异亦无统计学意义（均P＞0.05），说明两组患者体外受精的治疗经过及结局均衡可比。在后续移植周期中，CS组和VD组各进行胚胎移植254个和242个周期，其中新鲜胚胎移植周期占比、移植卵裂期胚胎/囊胚比例、移植日子宫内膜厚度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。CS组每周期移植胚胎数低于VD组（P＜0.05），且困难移植周期占比高于VD组（P＜0.05），见表 2。

2.2 两组患者妊娠结局比较 CS组患者每移植周期的hCG阳性率、临床妊娠率及活产率均低于VD组（均P＜0.05），但两组患者的胚胎种植率、流产率及异位妊娠率比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

2.3 既往剖宫产史对体外受精-胚胎移植妊娠结局影响的GEE模型分析 单因素分析结果显示：年龄、既往剖宫产史、移植胚胎个数、移植胚胎质量均对妊娠结局有明显影响（均P＜0.05），其中既往剖宫产史对hCG阳性率、临床妊娠率及活产率虽均有明显影响（均P＜0.05），但将上述因素作为混杂因素共同纳入GEE模型进行校正之后，既往剖宫产史的校正OR值均不再具有统计学意义（均P＞0.05），见表4。

2.4 既往剖宫产史对体外受精-冻融胚胎移植妊娠结局影响的GEE模型分析 剔除新鲜胚胎移植周期，仅观察既往剖宫产史在冻融胚胎移植周期中对妊娠结局的影响。结果显示，与在所有周期中的分析结果一致，CS组每周期的妊娠结局与VD组比较有统计学差异（P＜0.05），而在平衡混杂因素后的GEE分析中，两组间的差异无统计学意义（均P＞0.05），见表5。

3 讨论

剖宫产率居高不下已成为一个全球化的问题，近年来剖宫产对女性远期生殖健康尤其是再次妊娠的影响越来越受到关注[5]。Gurol-Urganci等[2]的Meta分析纳入了16项研究，结果提示与经阴道分娩史相比，既往剖宫产史妇女的妊娠率下降9%，活产率下降11%。剖宫产史影响再次妊娠可能的病理生理机制尚未明确，推测与干扰着床以及引起盆腔粘连、炎症等有关[2]。在我国二孩政策开放以来，越来越多有剖宫产史的妇女需要借助于辅助生殖技术解决再生育问题，而这些患者的助孕结局与仅有经阴道分娩史患者相比是否存在差异仍无定论。本研究将近3年因再生育要求而于本院行体外受精-胚胎移植的患者分为CS组与VD组，比较其妊娠结局，GEE模型分析结果显示CS组hCG阳性率、临床妊娠率及活产率与VD组比较无统计学差异。因此，暂无证据表明CS组的体外受精-胚胎移植结局劣于CD组。

表2 两组患者体外受精与胚胎移植周期特征比较

表3 两组妊娠结局比较[例（%）]

既往已有研究比较了不同分娩方式对体外受精-新鲜胚胎移植妊娠结局的影响，但受限于样本量及研究设计的异质性，结果不尽一致。Zhang等[3]认为剖宫产史并不影响新鲜胚胎移植的临床妊娠率、流产率、异位妊娠率及活产率，但该研究中VD组的年龄、不孕年限、移植胚胎数均明显高于CS组。Patounakis等[6]平衡了组间的年龄、移植胚胎数、胚胎质量等混杂因素后认为，前次分娩方式并不影响新鲜胚胎移植的hCG阳性率、临床妊娠率及活产率，但未限制既往的分娩次数。Wang等[4]认为剖宫产史可降低新鲜胚胎种植率及临床妊娠率，但并不影响流产率及异位妊娠率，该研究同样未限制既往分娩次数。王婷等[7]发现，既往不同分娩方式组间临床妊娠率存在显著差异，但在单卵裂期胚胎/单囊胚移植亚组中显著性消失。Vissers等[8]将研究对象限于既往仅有1次分娩史的患者，结果显示CS组活产率、临床妊娠率、hCG阳性率均低于VD组8%～9%，且校正了年龄、BMI、不孕原因等混杂因素后显著性仍然存在，提示剖宫产史会影响新鲜胚胎移植周期中胚胎早期种植过程（hCG阳性），但一旦着床后两组间的临床妊娠结局无明显差异。

迄今为止，涉及不同分娩方式对体外受精-融冻胚胎移植妊娠结局影响的报道较少，且结论尚不能统一。郭培培等[9]回顾性比较了剖宫产后子宫切口憩室（previous cesarean scar defect，PCSD）组、剖宫产后无子宫切口憩室（no previous cesarean scar defect，NPCSD）组及对照组3者间融冻胚胎移植的妊娠结局，发现单胚胎移植周期3组间种植率及临床妊娠率比较无统计学差异，双胚胎移植周期PCSD组胚胎种植率及临床妊娠率显著低于NPCSD组及对照组。但该研究的对照组为同期行冻融胚胎移植的输卵管因素不孕患者，未提及是否有经阴道分娩史，且未平衡不孕年限、不孕因素等基线资料。van den Tweel等[10]综合比较CS和VD组新鲜及冻融胚胎移植周期的妊娠结局，发现CS组活产率明显低于VD组，每临床妊娠周期的流产率高于VD组，而每移植周期的临床妊娠率无统计学差异。在该研究中两组的新鲜胚胎周期占比约30%，每例患者移植的胚胎来源于多个取卵周期，且＞50%的患者缺失BMI等重要的基线资料。本研究中两组患者的冻胚移植周期占比达90%，且所移植的胚胎均来源于首个取卵周期，避免因不同取卵周期造成的混杂。本研究结果发现CS组hCG阳性率、临床妊娠率及活产率均显著低于VD组，两组间的胚胎种植率、流产率及异位妊娠率比较均无统计学差异，而在平衡了年龄、移植胚胎个数等混杂因素后，剖宫产史对于妊娠结局的OR值不再具有统计学意义。该分析结果与van den Tweel等[10]的结论不一致，可能与不同的研究设计及不同的冻胚周期占比有关。

表4 既往剖宫产史对体外受精-胚胎移植妊娠结局影响的GEE模型分析[例（%）]

表5 既往剖宫产史对体外受精-冻融胚胎移植妊娠结局影响的GEE模型分析[例（%）]

剖宫产切口处瘢痕及其周围的肌层收缩功能差、液体引流不畅导致宫腔积液被认为是影响胚胎着床的因素之一[11]。Wang等[12]的横断面研究发现，一次剖宫产术后发生PCSD的概率可达61%，自然周期中观察到PCSD合并宫腔积液的概率约13.3%。Lawrenz等[13]的前瞻性研究发现，在超促排卵过程中40%的PCSD患者出现宫腔积液，而在冻胚移植周期中这个概率下降到9.4%。超促排卵过程中宫腔积液的形成原理尚未被完全阐明，可能与排卵前促性腺激素对腹膜的刺激导致过量腹腔积液的产生（非卵巢过度刺激综合征）并经输卵管流入宫腔有关[14]。由于冻融胚胎移植占到本研究移植周期的90%，这也部分解释了本研究观察到CS组与VD组妊娠结局无统计学差异的原因。虽然单因素分析结果提示新鲜或冻融胚胎移植并未显著影响妊娠结局，但因新鲜周期占比过低，尚不能认为两种移植策略的妊娠结局没有差异。

剖宫产史增加胚胎移植困难程度被认为是另一个可能影响妊娠结局的原因。本研究中困难移植被定义为使用硬芯移植管和/或移植术后检查移植管血染。CS组困难移植的比例高于VD组，与Wang等[4]及Patounakis等[6]的结果一致。子宫切口愈合不良乃至憩室形成常导致子宫下段解剖学改变，尤其对于后位子宫，子宫下段常被粘连上提，子宫后倾曲度增加，普通移植软管易反复进入未愈合的手术瘢痕或憩室内，导致困难移植。在这种情况下需借助硬芯引导管将胚胎移植管准确引导至宫腔内。既往对于硬芯引导管的使用是否会影响妊娠结局存在争议，笔者认为有经验的操作者在常规经腹部超声引导下轻柔操作可以避免硬芯引导管损伤子宫内膜并将胚胎放置最佳的位置，并不会影响妊娠结局，与既往Nielsen等[15]的报道一致。移植管血染常被视为内膜损伤的标志，但一项随机对照研究发现，在新鲜周期胚胎移植中移植管血染并不影响妊娠结局[16]，且对于剖宫产术后瘢痕愈合不良的患者，这些血染也可能来源于积聚在剖宫产切口处的血液而非损伤的内膜[6]。因此，笔者认为既往剖宫产史的确会增加胚胎移植的困难程度，但这并不影响妊娠结局，与Patounakis等[6]的结论一致。

本研究中一例患者可能重复进行了多次胚胎移植而贡献多个测量数据，其移植的胚胎均来自第一个取卵周期，因此这些数据间具有相关性，属于非独立的重复测量资料。对于这样的资料如果将每一次移植视作一次独立测量而采用传统检验方法则会导致移植次数越多的患者所占权重越大，易得出错误结论。GEE模型是在广义线性模型的基础上发展起来的、专门用于处理重复测量资料的统计模型。除了正态分布资料，GEE利用多种连接函数可将多种分布的应变量拟合为相应的统计模型，解决了重复测量数据非独立的问题，同时利用纵向数据中每次测量的结果，大大减少信息的损失，可以得到稳健的参数，使得对临床治疗结局的评价更为客观[17]。本研究采用GEE模型比较不同分娩方式对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响，在平衡年龄等诸多混杂因素后发现剖宫产史对妊娠结局的OR值不再具有统计学意义，同时在冻融胚胎移植亚组中重复上述过程，结果保持一致。虽然本研究的样本量有限，但通过GEE模型充分利用了重复移植周期的所有信息，增加了结果的稳定性及可信性。因此，尚不能认为剖宫产史对体外受精的妊娠结局具有显著影响，尤其是在冻融胚胎移植周期中。

综上所述，笔者认为既往剖宫产或经阴道分娩两种方式并不影响体外受精-胚胎移植的助孕结局，对于有剖宫产史的患者可首先考虑行冻融胚胎移植。