Satb2基因慢病毒载体的构建及其鉴定

陈晓霞，颜世果，李玉兰

1.陕西省康复医院口腔科，陕西 西安 710065；2.山东大学口腔医学院牙周科 山东省口腔生物医学重点实验室，山东 济南 250012

牙周病是危害人类健康的三大疾病之一。目前牙周病虽然可以通过系统的牙周治疗取得良好的炎症控制和功能改善[1-3]，但牙槽骨一旦发生吸收就很难重建，这也是很多牙周炎患者最终拔牙的主要原因。为寻找一种因子在基因水平上调控牙槽骨组织的再生，从而使缺失的牙周支持组织得以重建已成为研究者们努力奋斗的方向。

特殊富含AT 序列结合白2 (special AT-rich sequence binding protein2，Satb2)是近十年来研究的热点基因，它是一种核基质蛋白，同时也是具有高活性的转录因子。已有研究发现在牙周创伤的小鼠模型中植入Satb2 过表达的牙囊细胞和骨髓基质细胞，经组织学检查均可观察到小鼠牙周缺损区骨质的再生和创伤愈合能力的增强，说明Satb2 蛋白在牙周创伤愈合的过程中起到了一定的促进作用[4]。但国内外对Satb2基因在牙周组织再生中的作用研究还是非常少，仍需要进一步探讨。本实验通过构建Satb2慢病毒表达载体，为进一步研究该基因在牙周组织再生中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pBS-SK-Satb2、293T细胞(山东省口腔生物医学重点实验室提供)；pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 及包装质粒Mix (美国Invitrogen)；E. coli DH5a感受态细菌(全式金公司)；Marker DL5000、Marker 15000、质粒大量提取纯化试剂盒、多功能凝胶回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；限制性内切酶PacⅠ和AscⅠ、T4DNA Ligase (Fermentas 公司)；POLOdelivererTM3000转染试剂(上海锐赛生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Satb2 基因引物设计与合成 参照Gen-Bank中目的基因Satb2 (NM-139146)序列设计PCR引物，同时在Satb2基因的上下游分别添加酶切位点PacⅠ和AscⅠ，上游引物为：5'-CTGTCATTAATTAAGCCAC CATGGAGCGGCGGAGCG-3'，下游引 物为：5'-TCTACGGCGCGCCTTATCTCTGGTCGGTTTCGGC-3'，引物序列中添加的酶切位点PacⅠ和AscⅠ分别用红色字体标出。

1.2.2 目的基因的扩增 以携带目的基因的质粒pBS-SK-Satb2 为模板扩增目的基因Satb2，参照说明书配制PCR反应体系，该循环体系如表1所示，循环结束后，采用1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并用凝胶回收试剂盒回收所需的目的片段。

1.2.3 重组慢病毒载体连接构建 Satb2 基因PCR产物和慢病毒载体分别用PacⅠ和AscⅠ进行双酶切，凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。酶切后的PCR产物及目的载体通过T4DNA ligase 连接，配置连接体系如下：10×T4连接酶缓冲液1 μL，PCR-酶切产物3 μL，pLenti6.3-MCS-IRES-EGFP 酶切产物2 μL，T4连接酶1 μL，补ddH2O至10 μL。将连接产物转化E. coli DH5α后，涂布于LA 平皿上过夜培养。第二日，挑取孤立的，圆滑的单菌落进行菌落PCR 实验，将鉴定结果呈阳性的克隆再接种到LB 液体培养基中，摇菌过夜，次日抽提质粒并进行酶切鉴定。将菌落PCR和酶切鉴定结果均呈阳性的单克隆重组慢病毒载体送测序，并进行基因序列比对，测序工作由宝生物工程有限公司完成。

表1 目的基因PCR循环体系

1.2.4 病毒包装与浓缩 提取重组慢病毒质粒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP，浓度保证在1 μg/μL 以上，DNA 的A260/A280在1.8～2.0。取两支无菌离心管分别加入1.5 mL Opti-MEM，一只管内加入载体质粒和包装质粒Mix 各6 μg，另一支管内加入POLOdelivererTM3000 转染试剂24 μL，轻轻混匀，室温孵育5 min，之后再将两管液体混合，并轻轻颠倒混匀，静置孵育20 min。取3 mL 混合液均匀滴加在状态良好的293T细胞培养皿中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养，分别于48 h、72 h、80 h后收集细胞上清液，先于4℃、3 000 r/min 离心10 min，其上清液经0.45 μm 膜滤器轻轻过滤于离心管中，再经4℃、22 000 r/min 离心2 h，弃上清液，沉淀用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)彻底溶解，最后收集至1.5 mL EP 管内，分装存于-80℃冰箱。通过采用荧光显微镜观察法来测定慢病毒滴度。

1.2.5 病毒感染293T细胞 感染前1 d取生长状态良好的293T 细胞以5×104密度接种于12 孔培养板中，使转染当天细胞密度达到80%左右。实验分为三组：A，重组慢病毒感染组；B，空载体感染组；C，未感染细胞对照组。A、B 组分别加入100 μL 重组慢病毒液和对照病毒液，同时加入终浓度为8 μg/mL 的Polybrene促进感染，感染24 h后更换新鲜培养液继续培养，感染72 h后观察各组荧光表达情况。

1.2.6 qPCR 法检测目的基因 将感染72 h 后的293T细胞利用Trizol法提取mRNA，经DNaseI处理后反转录成cDNA，然后采用qPCR 检测目的基因Satb2的表达，引物设计如表2。

表2 目的基因qPCR引物设计

2 结果

2.1 重组慢病毒菌落PCR 鉴定 挑取经筛选后呈单克隆生长的菌落进行PCR扩增，电泳得到一条约2 202 bp的亮带，与目的基因长度相符，见图1。

图1 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP重组载体菌落PCR鉴定

2.2 重组慢病毒酶切鉴定 重组慢病毒载体pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 用PacⅠ和AscⅠ对其进行双酶切，最终得到两条亮带，大片段约9.1 kb，小片段约2 202 bp，与目的基因相符，见图2。

图2 pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP酶切鉴定

2.3 测序结果 将菌落PCR 和酶切鉴定结果均呈阳性的重组慢病毒载体送测序，并进行基因序列比对，结果显示，Satb2 基因序列与GenBank 报道的序列完全一致，见图3。

图3 Satb2测序图

2.4 慢病毒包装及滴度测定结果 重组慢病毒pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP 及空载体分别与包装质粒Mix共转染293T细胞后，收集、浓缩病毒液，取其中一支病毒液10 倍倍比稀释后分别感染293T 细胞，感染72 h 后在荧光显微镜下观察结果并选取合适的孔进行细胞计数。根据荧光显微镜观察法的测定公式计算出重组慢病毒滴度为7.9×107ifu/mL，空载体慢病毒滴度为1×108ifu/mL。

2.5 慢病毒感染293T细胞结果 重组慢病毒(A组)及空载体慢病毒(B组)感染293T细胞72 h后，在荧光显微镜下可以观察到大量荧光，感染效率达到70%左右，未感染组(C组)细胞未见荧光表达，见图4～6。

图4 重组慢病毒感染293T细胞（A组）

2.6 目的基因Satb2 的表达 慢病毒感染293T细胞72 h 后，利用qPCR 检测目的基因Satb2 的表达，结果显示A 组Satb2 mRNA 的表达量增加了约106倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，而B 组和C 组目的基因的表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。

图6 正常293T细胞（C组）

图7 目的基因检测

3 讨论

Satb2 是一种新型特殊富含AT 序列的DNA 结合蛋白，它可以与核基质附着区(nuclear matrix regions，MARs)结合并能以MAR依赖的方式同时激活多个基因的转录[5-6]。现有的研究发现Satb2作为一个高级调控因子同时参与了多种重要组织的生物学过程，如在中枢神经系统的发育；颅面形态的形成、发育；成骨细胞的分化、成熟；上腭的形成以及肿瘤的发生等方面都起着重要作用[7-10]。尤其在骨骼发育过程中，Satb2不仅可以通过调节多种特异性成骨基因的转录来影响骨组织的形成，而且还可以通过协同作用增强其他转录因子如runx2、osx、Atf4的活性来调节骨发生和成骨细胞分化[11-13]，说明Satb2在促进成骨细胞分化和骨再生的过程中是一个强有力的转录因子。DOWREY等[14]通过研究推测Satb2 可能通过两种机制调节骨的增殖，首先Satb2 可能调节前成骨细胞周期变换所必需基因的表达；第二，与其他MAR 结合蛋白类似，Satb2 可能参与DNA 复制。Satb2-/-基因敲除小鼠表现出下颌远端骨骼发育不全，出生时，缺乏Satb2 的小鼠出现严重下颌后缩并死于腭裂[15]。张瑾[4]研究发现，Satb2 在牙胚中表达，说明Satb2在牙齿、牙周组织发育中也起着一定作用。在模拟牙周创伤的小鼠模型实验中，过表达Satb2 能够促进骨髓间充质干细胞、牙囊细胞及诱导多能干细胞向成骨细胞分化，从而促进小鼠牙周创伤区的愈合[4]，同样过表达Satb2的大鼠骨髓间充质干细胞能显著增强牙科种植体周围新骨的形成和骨密度[16]，由此说明Satb2 在牙周组织骨再生中发挥了一定作用。BANĚČKOVÁ等[17]发现在牙龈区的骨化和部分非骨化的外周口腔纤维瘤中可检测到Satb2 的表达，可推断Satb2 在牙周来源的纤维瘤变过程中也发挥作用。另外，Satb2 相关综合征是一种新近被描述的临床综合征，其特征表现为发育迟缓/智力残疾、语言发育缺失或受限、颅面异常(包含腭部和牙齿异常)、行为问题和畸形特征等[18-19]。Satb2 基因异常的患者口腔临床表现可以有牙齿迟萌、夜磨牙、流涎、过大牙等症状；影像学表现则有牙根形成延迟、严重迟萌或第二双尖牙缺失、畸形牙和牛牙症等[20]，说明Satb2 基因异常影响人类牙齿的形成和发育。尽管现有的研究已经证实Satb2 在牙齿发育、牙周组织骨再生等方面发挥了一定作用，但其能否作为牙周组织再生的理想因子仍需要进一步探讨和研究。

本实验通过PCR 技术扩增出目的基因Satb2，然后利用PacⅠ和AscⅠ两个酶切位点将其插入到慢病毒pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST 之中，从而成功构建了携带Satb2 基因的慢病毒表达载体pLenti6.3-Satb2-IRES-EGFP。该慢病毒经过包装、浓缩，病毒浓度达到7.9×107ifu/mL，我们利用病毒液感染293T细胞后可以观察到大量荧光，并检测出目的基因mRNA的过表达，说明我们包装出的病毒颗粒具有感染活性，从而为进一步研究目的基因Satb2 在牙周组织再生过程中所起的作用奠定了基础。