乳腺癌患者来源肿瘤异种移植模型的临床应用与进展△

孙卫欣，薛婷，尹光浩#

1吉林省前卫医院药学部，长春130012

2吉林大学第二医院乳腺外科，长春1300410

1 乳腺癌的治疗现状

全球肿瘤流行病统计数据显示，乳腺癌已经成为女性发病率最高的恶性肿瘤[1]。近年来，亚洲地区乳腺癌的发病率逐年升高，且呈年轻化趋势。随着医疗技术的不断发展及抗肿瘤药物的研究与开发，乳腺癌患者的生存情况得到显著改善。但是，TNM 分期为Ⅰ～Ⅲ期的原发乳腺癌患者的10年复发率仍约为5.8%，其中，大多数患者的复发与原发性或继发性耐药机制的产生有关。可见，乳腺癌患者对抗肿瘤药物的耐药问题严重制约着其治疗效果。

乳腺癌的异质性主要表现在组织学、基因组学、蛋白质组学及治疗效果等方面，而此种异质性尚不能通过组织病理学、肿瘤大小、临床分期、淋巴结受累数目及肿瘤标志物等临床相关参数得到精确的评估。乳腺癌在不同个体中呈高度异质性[2]，而很多新技术、新疗法在Ⅲ期临床试验阶段又到达了瓶颈期，因此，如何建立更加有效的临床前模型并推动抗肿瘤药物的研发成为了现阶段乳腺癌领域亟待解决的问题。

目前，普遍提倡通过对基因组医学和药物基因组学的研究为患有相同疾病的不同患者亚群个体化治疗方案的制订提供更加可靠的理论依据。患者来源肿瘤异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型能够保持其原始样本的分子异质性，为研究出更加有疗效的抗肿瘤药物提供了强有力的工具。PDX 的潜在应用非常广泛，包括新的治疗靶点的识别、最佳治疗方案的制订、化疗效果的分析和药物组合的临床前评估，以及生物标志物的识别和新的耐药机制的发现[3]。对这些特征的探索有利于对恶性肿瘤进行更深入的研究，使前期实验更加契合临床真实事件[4]。

2 乳腺癌体外模型的建立与优化

几十年来，生物学家一直采用肿瘤单细胞层体外培养的方式从培养的肿瘤细胞中提取小鼠异种移植物进行生物学特征的研究[5]。然而，数据表明，肿瘤细胞株的生长与其实际来源肿瘤的增殖方式存在很大差异。在细胞传代的过程中，由于应用大量培养基进行培养，导致细胞内遗传物质改变和细胞系污染等事件的情况时有发生[6]。此外，连续细胞系在代数增加的同时，在细胞表型、细胞功能以及对疾病模型的反应机制等方面出现了与原代细胞完全不同的情况。因此，细胞系是无法如实反映符合人类肿瘤微环境的变化的，特别是在某些通路和疾病功能的研究中，细胞系实验的缺点逐渐暴露。细胞培养模型中基因表达的模式越来越单一，表明肿瘤一旦从患者体内被取出，脱离了正常的生长环境，转而在实验室中培养，其异质性就会消失[2]。在细胞培养的过程中，选择性压力使分化程度最低的细胞得以生长，因此，经过长时间的培养，大多数细胞系已适应了体外环境，产生了与人类不同的异质性，在遗传学和表型上与其起源细胞均大有不同[7]。为了更好地构建人体肿瘤原本的生长环境，尽可能地保留肿瘤自身的特征，人们提出了PDX 模型这一概念。其实，早期PDX 模型的雏形是通过辐射或激素等干预方法从大鼠中获得的人类表皮样癌。此外，也可通过将人结直肠癌组织移植至裸鼠身上，利用动物模型研究恶性肿瘤。1987 年，加州大学医学中心在裸鼠中建立了黑色素瘤的异种移植动物模型，改善了移植率低的问题。这些移植成功的模型均为抗肿瘤药物疗效的预测、靶向药物的寻找奠定了基础[8]。

目前，广泛应用于乳腺癌领域的细胞工具包括人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-435S 和MDA-MB-453 等[9-11]。但是，由于这些细胞系的无限传代与培养，其表面的糖蛋白减少，细胞之间的黏着性降低，一些基因无法正常表达。

3 乳腺癌体内模型

3.1 用于一线基础研究的动物模型

3.1.1 T 淋巴细胞功能缺陷鼠 目前，BALB/c-nu

裸鼠已成为医学研究领域不可或缺的的实验动物模型。此小鼠无胸腺，为免疫缺陷鼠，不能产生T细胞。随着年龄的增长，皮肤角质层变薄，头颈部皮肤失去弹性，生长发育速度逐渐变慢，虽然B 淋巴细胞正常，但其免疫功能欠佳。裸鼠自发肿瘤现象罕见，抵抗力差，容易患病毒性肝炎和肺炎。

3.1.2 B 淋巴细胞功能缺陷鼠 重症联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠是自发性的SCID 突变鼠系，T 细胞和B 细胞的发育和成熟受到阻碍。但是，SCID 小鼠有正常的NK细胞、巨噬细胞和粒细胞，其外观与正常小鼠相同。但是，SCID小鼠免疫器官的重量未达到正常小鼠的30%。SCID 小鼠是PDX 模型的良好宿主[12]。少数SCID 小鼠的免疫功能在青年期可出现一定程度的恢复，这与小鼠的年龄、品系、饲养环境有关。SCID 小鼠易被感染，在高度洁净的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）环境下可存活1 年以上。SCID 小鼠自发性T 细胞淋巴瘤的发病率为15%左右，起源于胸腺，并可发生多部位转移。

非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodeficiency，NODSCID）小鼠是基于SCID 小鼠而研发出的免疫缺陷鼠[13]。与SCID 鼠相比，其NK 细胞的活性较低，免疫恢复的概率更低。SCID 突变基因的纯合影响了T、B 淋巴细胞的正常发育。NOD-SCID 小鼠既存在先天免疫缺陷，又缺乏T、B 淋巴细胞，适用于各种肿瘤组织的移植。但是，NOD-SCID 小鼠更易发生淋巴瘤，且存活时间较短。

3.1.3 重度免疫缺陷鼠 近年来，在NOD-SCID 小鼠的背景下敲除白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）受体基因得到了NSG 小鼠。与其他免疫缺陷鼠相比，NSG 小鼠的移植成功率最高，能够接受更多的移植物。值得注意的是，NSG 小鼠还能实现人类免疫系统的重建，植入人类造血干细胞后，NSG 小鼠的外周淋巴组织可以产生人类T 细胞。

3.1.4 B、T 淋巴细胞及自然杀伤细胞功能缺陷鼠Beige（bg）小鼠是细胞活性缺陷的突变系小鼠，该品系为SCID 和Beige 基因突变小鼠。该小鼠的特点为自然杀伤细胞发育和功能缺陷，巨噬细胞活性降低，免疫抗肿瘤杀伤作用出现的时间较迟，细胞毒性T 细胞功能缺乏，体液免疫减弱。该品系适用于免疫学研究，尤其是各种致病因子的应用，但需要达到SPF 级小鼠培养的环境要求。

3.2 PDX 建立方法

3.2.1 组织移植 建立PDX 模型的常用方法是提取患者的肿瘤组织并移植在免疫缺陷鼠皮下。首先通过手术或活检收集患者的原发肿瘤组织，将其用无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3 次，然后将无菌培养皿置于冰上，于培养皿中切成﹤1 mm3大小的块状。麻醉免疫缺陷小鼠，使用眼科剪剪开约0.5 cm 切口，使用器械将筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入小鼠乳腺相应的部位。这些处于移植阶段的小鼠称为F1 小鼠。当肿瘤生长并达到直径约1.5 cm 时，将F1 鼠的肿瘤组织移植到另一只免疫缺陷鼠上，方法同F1 移植过程，处于该扩增期的小鼠称为F2 小鼠。观察肿瘤生长情况，当肿瘤体积达到100～150 mm3时，肿瘤组织可用于下游应用[14]。

3.2.2 细胞悬液移植 细胞悬液移植指的是注射细胞悬液于移植部位，具体方法：将组织剪碎成大小为1～2 mm3的小块，将组织研至匀浆；冲洗并收集细胞悬液，滤网过滤细胞，离心沉淀，充分冲洗细胞后，用注射器吸取带有基质胶的肿瘤细胞，并注射入皮下，其他步骤同上[15]。

3.3 体内模型建立的影响因素

移植肿瘤时，肿瘤组织块的大小与肿瘤细胞的成活率关系密切，组织块过大会阻碍肿瘤细胞与生长环境的结合。同时，应确保肿瘤组织的活力，避免移植入无效的肿瘤组织[16]。基质胶可为肿瘤细胞起到提供营养、聚集细胞的作用[17]。因此，在移植过程中加入基质胶会提高移植的成功率[18]。

肿瘤细胞离体的时间对于移植的成功率亦具有重要影响。由于肿瘤组织离体后会处于缺血、缺氧的状态，因此，会对组织和细胞的生长发育不利，进而影响PDX 模型移植的成功率。因此，将肿瘤细胞收集后种植到小鼠皮下的时间不宜过长，一般应在2～3 h 内完成，并且需要外科医师与研究者密切配合。

4 PDX 的优势与不足

4.1 优势

经过长期的体外培养，传统细胞系移植模型（cell-derived xenograft，CDX）的肿瘤细胞逐渐适应了外环境，丧失了异质性，获得的实验结果趋于同质化[19]。然而，PDX 模型中，移植的标本来自人体肿瘤组织，充分保留了肿瘤间质和细胞成分，使肿瘤生长的微环境更接近原发瘤；通过患者自身的肿瘤组织构建的PDX 模型能够反映个体的差异，更接近患者的实际情况[20]，有助于研发出针对个体的抗肿瘤药物和检测出自身特有的生物标志物；收集的标本也可为今后的研究提供大量的参考。未经过体外培养的PDX 模型稳定地保留了原发瘤的遗传特性、组织学和表型特征，实验结果显示临床预见性更好[21-22]，通过肿瘤标志物评估肿瘤情况，可用于测试抗肿瘤药物的敏感性和预测患者的预后，实现肿瘤的个体化治疗。

4.2 不足

各种数据及分析均表明PDX 模型的建立比长期建立的细胞系和标准异种移植物更符合临床恶性肿瘤的表型，但是，PDX 模型并未广泛应用于实验中，主要存在以下影响因素[23]。

成本是PDX 模型未广泛应用于临床的一个主要问题。为了得到有效的结果，每个样本需要移植大量的受体鼠，同时，肿瘤移植物仅能在小鼠体内维持，与单纯维持培养细胞株相比，其培养及传代需要更洁净的培养环境及专业的技能，大大增加了成本。另外，制模周期过长，一般需观察3～6个月才能决定模型是否成功[24]。由于人和鼠为不同的物种，因此，物种间的差异依然会存在。小鼠的环境会逐渐取代原发肿瘤的生长环境。肿瘤组织在小鼠体内传代过程中的一些不可控因素也可能导致个别基因的改变而无法准确反映患者的病情。

由于PDX 模型的构建需要免疫缺陷动物，而对免疫调节药物或通过免疫功能激活的药物研究就会限制此种模型的应用[25]。乳腺癌PDX 模型的成功率较低又是当前研究面临的一个影响实验进程的重要因素，为了提高PDX 模型的成功率，移植过程中需要注意以下问题：①肿瘤自身因素，与其他肿瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX 模型建模更难。主要由于这两种疾病的发生与激素水平有关。②实验用鼠多为重度免疫缺陷小鼠。这些小鼠的免疫缺陷程度较高，可以保证相对较高的移植成功率，但也会为其他肿瘤的发生提供可能。③为了保证移植肿瘤的质量，需要有经验的外科医师判断提取的是肿瘤细胞且无坏死组织。

5 小结与展望

近年来，关于PDX 模型应用于乳腺癌的研究越来越多，Ramani 等[26]通过应用三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）患者的PDX 模型对循环肿瘤细胞及其远处转移情况进行研究，结果显示，PDX 肿瘤模型对于研究TNBC 具有重要意义。此外，Rosato 等[27]通过检测人源化抗程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）单克隆抗体研究TNBC 患者PDX 模型的体内活性，结果显示，抗PD-1 抗体可显著抑制部分PDX 肿瘤株的生长，并提高患者的生存率，表明PDX 模型在乳腺癌药物的筛选中起到重要的作用，且应用前景广泛。

乳腺癌PDX 模型保存了原发肿瘤的分子特性、遗传性和异质性，为检测和比较不同抗肿瘤药物治疗效果提供了高效、可靠的工具，有望进一步推动乳腺癌临床治疗方案的优化与革新[28]。

PDX 模型优于传统的肿瘤细胞系异种移植模型，主要由于其与亲代肿瘤有更多的相似之处[29]。目前，PDX 模型作为恶性肿瘤研究的可靠临床前模型越来越被研究者们接受[30]，其维持了供体肿瘤的生物学特性，具有良好的临床预测性。就目前的情况及数据调查结果显示，通过PDX 模型实现个体化治疗还未达到实质性的进展，仍处于临床验证阶段。因此，迫切需要更好、更具有临床预测性的人类恶性肿瘤模型。有研究发现了另一种能反映人类恶性肿瘤的模型——人源肿瘤类器官模型（patient-derived organoid，PDO），研究者从人体中提取多能干细胞，通过短暂地低渗裂解红细胞，计算细胞数量和生存能力。通过给予基质胶等进行极小的刺激，从而促进其分化，并任其自由生长。这些细胞会自动根据种类分开，并排列成特定的空间构型，经过几个月的培养，长成类似于人体器官结构的“类器官”[31]。经肿瘤组织培养出的“类器官”未来能够更好地反映肿瘤的特点，可用于药物反应性试验等研究。无论PDX 模型还是PDO 模型，都是通过改变动物模型的条件形成符合人类的肿瘤微环境，以对人类最小的损伤达到临床最佳的效果。这些尝试对乳腺癌新药的研发及作用机制的研究均具有重要意义[32]，进一步推进了乳腺癌个体化治疗的进程，并促进其研究结果向临床转化。