生物样品前处理技术在脂质分析中的应用

贾 波，吴津津，张云静,3

（1.襄阳市公共检验检测中心，湖北襄阳441000；2.安徽中医药大学药学院，安徽合肥230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽合肥230012）

脂质是一类完全或者部分由硫酯的碳负离子缩合或由异戊二烯的碳正离子缩合产生的疏水或两亲性的小分子[1]。根据脂质化学结构差异，脂质主要分为脂肪酰类（fatty acyls）、甘油脂类（glycerolipids）、甘油磷脂类（glycerol-phospholipids）、鞘脂类(sphingolipids)、固醇脂类（smrol|ipids）、异戊烯醇类（prenol lipids）、糖脂类（saccharolipids）、聚酮体类（polyketides）八大类别。每一类型的脂质又由于极性头基、碳链长度或不饱和度的差异形成不同的结构，由此组成种类繁多、性质各异的脂质分子。作为生物系统中一类重要的小分子，脂质在许多生物过程中起着多种重要作用[2-3]。脂质是形成细胞膜和亚细胞膜的基质，保证了细胞膜的完整性。此外，脂质还参与了细胞间和细胞内的信号传递[4]，脂质合成和代谢的异常会导致动脉粥样硬化、高血脂症、老年痴呆症和癌症[5-8]等疾病。

脂质组学是对整体脂质进行分析的学科，对脂质组学的深入研究在探索生命活动和疾病机理、疾病的预防控制及诊断、揭示药物对生物体的作用机制、药物研发、环境学、营养与健康以及食品科学等方面有着重要的意义[9]。脂质组学主要对生物样本代谢产物进行定性和定量研究，分析对象多为生物样本，大多数生物来源中样本均可提取脂质进行分析，包括血浆、血清、全血、干血斑、脑脊液、组织、尿液、细胞、粪便、植物、微生物等。准确、灵敏、可靠的脂质分析方法至关重要。质谱法已经成为研究脂质最有利的工具之一[10]，目前常采用质谱-色谱联用技术对脂质进行分离和研究，包括气相色谱-质谱法（GC-MS）、液相色谱-质谱法（LC-MS）、超临界流体色谱-质谱法（SFC-MS）等，其中以GC-MS研究历史最长并涵盖了丰富的标准数据。由于生物样品成分复杂，分析之前需要对样本进行前处理。GC-MS所需的高温条件容易破坏不稳定的脂质组份，因此挥发性脂质需提前进行衍生化处理。

脂质分析的第一步是在提取脂质前正确地采集和储存生物样品。样品采集后应尽快进行脂质提取，以限制脂质的降解，否则应立刻进行冷冻保存。第二步是从生物样品中提取脂质[11-12]。本文对脂质组学分析中生物样本前处理研究现状进行了综述，对其发展趋势进行了展望。

1 基于液相的萃取方法

1.1 液液萃取

液液萃取（LLE）是脂质组学研究中最常用的生物样本前处理制备方法，利用目标组分在互不相溶溶剂中的溶解度不同而达到分离，分离效率高。由于脂质不溶于水，常用有机溶剂作为提取溶剂，细胞组织、血浆、血清等生物样本都可以利用液液萃取进行前处理，其中最常用的三种方法是Folch法、Bligh-Dyer法和Matyash法[13]。其中Folch法是最广泛的使用方法，利用氯仿∶甲醇∶水（8∶4∶3，V/V/V）混合溶剂进行全脂提取，脂质在氯仿中浓缩。Bligh-Dyer法是对Folch法的改进，利用相同的溶剂体系，但不同体积比的氯仿∶甲醇∶水（2∶2∶1.8），以此减少有机溶剂用量，与Folch法相比，提高了提取效率，获得了较高的脂质回收率。

上述两种提取方法在进行脂质提取时，由于含有脂质的有机相位于两相溶液的下层，都容易损失样品并且可能造成溶液污染，且氯仿具有致癌性。Matyash等[14]使用低密度甲基叔丁酰乙醚（MTBE）∶甲醇∶水（10∶3∶2.5，V/V/V）提取生物样品中的脂质组份，使用MTBE代替氯仿，降低了溶剂的毒性。Matyash法与上述两种方法提取效率相当。

基于液液萃取方法的脂质组学萃取体系在以上三种方法上不断改进，在多个领域展开应用，不同方法的效果比较拥有大量的文献资料。Ulmer等[15]研究了这三种方法对人血浆脂质组学的提取效率，发现Folch或Bligh-Dyer方法的血浆样品与总溶剂比为1∶20（V/V）时提取效率最高。Vale G等[16]提出了一种不同于上述萃取方法的三相液体萃取（3PLE）方法，3PLE包括使用两个有机相和一个水相，以来源不同的生物样品，如牛肝、人血浆和小鼠肝来进行脂质提取，成功地获得了78种脂质。

1.2 单一有机溶剂萃取

单一有机溶剂萃取（Single Organic Solvent Extraction，SOSE）是一种只使用一种有机溶剂的样品制备方法，因此比两相和三相混合萃取更简单和方便，甲醇是SOSE中最常用的有机溶剂，能从不同基质中提取出极性代谢物。异丙醇是SOSE中第二种最常用的脂质分析溶剂。Christinat等[17]利用异丙醇单一有机溶剂提取96个人血浆样品中的非酯化脂肪酸。Merrill等[18]通过单相异丙醇对神经元样品提取，经过比对，针对该实验的神经元提取，SOSE方法的回收率和nLC/MS峰形最优。联合一种优化的LC-MS检测从哺乳动物活脑中鉴定的神经元中（采用膜片钳技术从灌流小鼠脑片中捕获神经元细胞体，并采用优化的纳米LC-MS联用技术对其脂质进行分析）获得40多种脂质。但是，SOSE在生物样本脂质前处理中应用有局限，由于其分离能力很差，即便操作简单，尚未广泛应用于生物样本的脂质前处理中。

2 基于固相的萃取方法

固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）是从上世纪80年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术，主要通过固相填料对样品组分的分配系数不同实现样品分离。根据材料的类型，商用SPE柱分为反相柱、正相柱和离子交换柱，在脂质分析中使用适当的SPE柱有助于抑制基质干扰，从而改善基质干扰、低丰度成分的检测灵敏度和回收率，以及扩大脂质种类的检测覆盖率。目前最常用的固相柱为C8和C18柱。SPE对脂质的选择性很高，因此是靶向脂质分析的首选方法。在SPE基础上发展起来的固相微萃取（Solid-Phase Micro-Extraction，SPME）同样得到了广泛应用。

SPME是一种由Arthur和Pawliszyn于1990年提出的样品制备方法，常使用一根带有涂层的纤维用于萃取分析物，基于静电作用、离子交换作用、疏水相互作用等作用力实现复杂生物样品中脂质的分离、纯化和富集[19]，目前使用较多的涂层有聚丙烯腈（PAN）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）和聚苯胺（PANI）等。SPME有效地降低了基质效应，这种方法通常与LC或LC-MS结合使用，对液体和固体样品等各种生物样品的分析具有良好实用性，分析效率高，易于自动化[20]。SPME局限性主要在于提取能力小，因此，主要适用于少量样本的前处理。

分散微固相萃取（dispersive Microsolid Phase Extraction，dMSPE）是近年来发展起来的一种改进型分散固相萃取技术。萃取过程包括：①将待测物捕集到直接分散在样品中的吸附剂中；②离心或过滤分离吸附剂；③用适当的解吸溶剂洗脱/解吸分析物。与传统的SPE相比，dMSPE的主要优点是溶剂消耗少、操作简便、时间短、净化效率高、吸附剂可以混合。Bakhytkyzy等[21]建立了人乳脂质组学的分散微萃取方法，采用实验设计（DoE）方法研究了提取工艺条件对脂质体覆盖率和重复性的影响，考查了脱附溶剂、固定相比、吸附时间等因素对萃取效果的影响。结果表明，以27 mg的C18与3 mg的氧化锆涂层硅胶混合作为吸附剂，甲醇∶2-丙醇∶氨水（14∶81∶5，V/V/V）混合物为解吸剂，提取100 μL的人乳样品，脂质覆盖率最高。吸附和解吸时间对提取没有影响。与脂质组学中传统的SPE和LLE相比，该法的优点是可混合具有各种吸附机制的吸附剂，确保较高的脂质体覆盖率，并且使用的材料少（包括吸附剂和有机溶剂碳水化合物）。

除此之外，磁性固相萃取（MSPE）同样是传统SPE的一种替代方法，MSPE以磁性或可磁化的材料作为吸附剂基质，凭借吸附剂的超顺磁性，在外界磁场作用下即可实现吸附剂与样品溶液的分离，操作简单、兼容性好、富集率高、快速、选择性好，从而避免了吸附剂填料、高背压或填料堵塞等问题。Wang等[22]采用微波辅助稳定同位素标记衍生化MSPE开发了一种测定大鼠血液微透析液中含羟基胆固醇和代谢物的方法，为阿尔茨海默病的诊断和治疗提供了技术支持。

近年来，越来越多的有机多孔金属材料出现，特别是金属-有机骨架材料（Metal-Organic Frameworks，MOFs）和共价-有机骨架材料（Covalent Organic Frameworks，COFs）在生物样品分离中得到广泛运用[23-26]。MOFs和COFs的化学活性高，且易于进行孔道修饰，由此发展出磁性MOFs和COFs复合材料，结合了各组分的有源性能，弥补了常规SPE的缺陷，有望在脂质分析样品前处理中展现出更广阔的应用前景。

3 其他萃取方法

研究表明：场效应，如压力、热量、超声和微波能量可能会提高传质速率，从而提高萃取率。因此，在传统的LLE和SPE技术上，许多其他方法，如微超临界流体提取法（SFE）、微波辅助提取法（MAE）、超声辅助提取法（UAE）等已经应用于脂质组学的样品前处理中。

3.1 超临界流体萃取法

超临界流体是指温度与压力均处于临界值以上的流体，SFE中最常用的超临界流体是超临界二氧化碳（SCCO2），其极性与戊烷相近，适合于疏水物质的萃取，并且无毒害，易于去除[27]。作为一种绿色的萃取方法，微超临界流体提取法（Supercritical Fluid Extraction，SFE）被广泛用于从不同基质中分离脂质。与传统的LLE方法相比，SFE具有萃取效率高、有机溶剂消耗少、通过降低压力实现无溶剂提取物等优点[28-29]。此外，SCCO2的惰性和低临界温度(31.06℃)可以防止高温和大气中氧气对不稳定化合物的潜在降解。然而，SCCO2的低极性可能导致极性分子的提取率降低，幸运的是，可以通过添加极性溶剂来解决这个问题。Barbi等[30]对一种巴西本土棕榈（Maximiliana Maripa）的果肉油样品进行了超临界流体脂质提取研究，比较了纯SCCO2、SCCO2乙醇共溶剂（SCCO2+EtOH）和乙醇加压液体萃取（Pressurized Liquid Extraction，PLE）的提取回收率。结果表明，在333.15 K和20 MPa条件下，纯SCCO2提取率较低；加入乙醇作为共溶剂，由于乙醇增加了混合溶剂的极性，使提取回收率升高了5倍多，PLE的回收率则更高。在SFE基础上发展形成SFE-MS技术，由于SCCO2的极性与脂质的极性相似，SFC-MS对SFE提取的脂类具有良好的分离能力。

3.2 微波辅助提取法

微波辅助提取法（Microwave-Assisted Extraction，MAE）是一种快速、高效的样品制备方法，在脂质谱中得到了广泛的应用[31-32]。其原理为利用离子传导和偶极旋转引起的热效应微波能加速萃取，使MAE更适合于热稳定分子的提取。在MAE中目标分子被选择性加热，取决于脂质和萃取溶剂微波吸收能力的差异，因此，MAE是一种更省时、更有效的方法。与传统的LLE相比，MAE能减少溶剂的消耗。Mustapha等[31]研究了氯仿、甲醇、乙醇、二氯甲烷等混合溶剂对斜生栅藻脂质提取的影响，采用氯仿/甲醇/乙醇/二氯甲烷混合溶剂组成（1∶5∶1∶1，V/V/V/V），与常用的氯仿-甲醇混合物组合物相比，成本较低，毒性较小，微波辅助脂质提取法提取微藻中的脂质回收率高达55.67%，与常规溶剂提取相比，提取的脂质质量不受影响。MAE的局限性在于不适用于热不稳定性物质。

3.3 超声辅助提取法

超声辅助提取法（Ultrasonic-Assisted Extraction，UAE）是利用超声波产生的机械振动、扩散等效应加速两相间物质传递，从而实现萃取的技术[33]。与传统的提取方法如LLE相比，UAE能更有效地进行脂质分析，缩短脂质提取的时间。除此之外，在UAE过程中不会升温，有利于热不稳定性物质的分析。Gulzar等[34]研究了不同预处理条件和气氛对超声波辅助提取凡纳滨对虾脂质提取率和氧化稳定性的影响，结果表明，真空-微波处理与UAE联用可提高脂质的提取率，在超声容器的上方吹氮，并加入单宁酸可显著抑制脂质的氧化和水解。将这些方法纳入提取过程可以从一定程度上抑制UAE对脂质提取的不良影响。

3.4 电迁移提取法

电迁移提取法是利用电场诱导带电化合物的选择性迁移进行的，由于脂质分子上的电荷不同，这种提取方式理论上非常适合靶向分析。电迁移提取常用的有两种方法：电膜萃取（Electromembrane Extraction，EME）和电提取（Electroextraction，EE）[35]。EME是基于电场中给予相和接受相相互作用，接受相在其空隙中被一种有机溶剂制成的膜（Supported Liquid Membrane，SLM）隔开，通过聚合材料组成的液膜，分析物从样品中萃取到接受相，并在接受相富集。EME使用液膜可以避免基质中的杂质，电场提高了萃取效率，适用于复杂生物样本中痕量物质的萃取，目前多用于从生物样本中提取小分子的药物。由于磷脂在生理pH条件下，具有两性离子性质，阻碍了其在电场中的净迁移，无法穿过SLM，从而实现磷脂的分离。EE是基于电迁移的富集方法，分析物通过一个或者多个液-液界面从一个大的给予相富集到一个小的接受相。给予相电场强度高，通过液-液系统电场中的电子驱动，代谢物进入低电场的受体相并富集。EME和EE由于可以在萃取过程中对待测物进行预富集，且易与检测技术在线连接，可实现自动化，有望用于高通量和低浓度脂质样品分析。但目前大多数报道都集中在小分子药物和代谢物的提取上[36]，在脂质提取中的应用有待开发。

4 总结与展望

样品制备是脂质分析的关键步骤之一。脂质组学中生物样本前处理方法选择对研究数据的准确性和检测灵敏度至关重要。由于生物样本种类繁多，且脂类的化学成分、极性和大小有很大差异，没有一种方法可以保证提取样品中所有脂质被提取。每种方法都有其优势和局限性，如固相微萃取法选择性高，但回收率较低。研究者必须认识到各种方法的优点和局限性，针对不同的脂质分析平台开发不同的样品制备方法。此外，脂质稳定性研究也应纳入方法开发的过程。新颖的前处理方法以及新型的萃取材料和试剂也值得关注，但实际应用价值仍有待开发和检验，如电迁移提取法等。研究开发更高通量、更高提取率、更简便和绿色的分离和提取工艺仍是脂质分析样品前处理的主要目标。