液体活检在肺癌中的应用

贺晶晶，高俊珍

（内蒙古医科大学附属医院 呼吸科，内蒙古 呼和浩特）

0 引言

肺癌是全球肿瘤相关死亡的首要原因，每年约有160 万人死于癌症，而每4 例癌症死亡中就有1 例死于肺癌。考虑到50%以上的患者在初次就诊和诊断时处于晚期疾病阶段，肺癌在临床、组织学和基因组学上存在着深刻的异质性，获得足够的组织以进行疾病的病理确认和辅助分子检测是需要面临的挑战[1-2]。靶向治疗的应用为晚期肺癌的治疗带来了新的希望。通过穿刺活检对转移性病变进行再分析是可能的，但它是侵入性有创检查，并且采用高度异质性肿瘤组织样本无法反映真实的疾病状态。液体活检，即通过分析血液样本中的肿瘤细胞或肿瘤细胞产物，可以克服这些障碍，原则上可以反映该特定时间点存在的所有亚克隆，并允许对疾病的进展进行连续动态监测。

液体活检最早在1974 年由Sarrell 等提出，当时指关节腔的滑液分析用于诊断滑膜疾病。而近期重新提出的液体活检的概念，涉及通过微创方法收集体液，例如血液、尿液、渗出液或唾液，并将进行临床试验这项新兴技术有可能绕过上述肿瘤活检的局限性，通过分析上述样本中的肿瘤细胞或肿瘤细胞产物，其生物标志物主要包括循环肿瘤细胞（C i r c ulating Tumor Cells, CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、外泌体（Exosomes）、肿瘤血小板（Tumor Educated Platelets, TEP）等。通过非侵入性的取样方法获得肿瘤细胞信息，是辅助肿瘤治疗的突破性检测技术，是精准医疗代表性的诊断技术之一，具有实时检测、重复取样、微创等优点[3]。

1 循环肿瘤细胞（CTC）

循环肿瘤细胞（CTC）最早是在1869 年由澳大利亚病理学家Ashworth 首次提出，他在死亡后的患者血液中发现了与肿瘤细胞相似的细胞。CTC 是指由原发灶或转移灶脱落进入外周血的肿瘤细胞，CTC 具有肿瘤干细胞特性，促进肿瘤及肿瘤耐药性的形成，同时CTC 能够发生上皮间质转化（EMT）行为，可以使得细胞失去细胞间黏附性，同时侵袭、迁移能力增强，易于粘附于血管壁并穿越，最终产生远处转移。EMT 是一个复杂的过程，通过细胞接触连接的重排，最终导致细胞粘附的丧失，从而导致细胞去分化和运动增强。在这一转变过程中，细胞将其上皮表型部分或完全转换为间充质表型。

EMT 是转移瘤形成的关键过程，其目的是使肿瘤细胞具有更好的侵袭性和生存特性，从而促进肿瘤细胞从原发部位脱离并转移到继发部位；此外，EMT 可能是部分或完全的。导致CTC 的高度异质性亚群，分别具有混合上皮间质或纯间质表型，单凭其免疫特性，已经经历过任何程度EMT 的CTC可能很难与正常造血细胞区分开来，而它们在血流中的水平升高可能作为更具侵袭性疾病过程的一个指标，具有重大的预后意义高转移潜能与耐药性。

但是，CTC 在血液中含量少，大概每100 万血细胞（1 mL血液）中混杂1个肿瘤细胞。因此进行CTC 研究时必须先进行富集，合理有效的富集方法就是最为重要也急需攻克的难题。主要的挑战是如何获得足够数量的、最佳条件的、可用于进一步评估的CTC。

2 循环肿瘤DNA（ctDNA）

液体活检在靶向肿瘤治疗领域也产生了很有希望的结果，因为循环游离DNA（cfDNA）的分析，特别是来自肿瘤细胞的部分，即循环肿瘤DNA（ctDNA）能够检测特定的基因改变，作为靶向治疗的潜在靶点[4]。cfDNA 和ctDNA 通过多种机制释放到血液中，包括凋亡、坏死甚至主动脱落。ctDNA被认为能够提供全身肿瘤的基因组图谱，具有更广阔的蓝景。液体活检所需的微创取样也提供了检测癌细胞在治疗过程中发生的分子变化的机会，并监测肿瘤负担和复发的发生。

1940 年Mandel 和Metais 首次提出了细胞外游离核酸的概念，ctDNA 是指来自肿瘤基因的DNA 片段，它随着人体血液循环系统不断的流动，并携带有基因突变、缺失、重排、拷贝数异常和甲基化等信息。一些研究报告表明，随着疾病的进展，ctDNA 水平迅速上升，而在切除手术和/或成功的药物治疗的情况下，ctDNA 水平下降。

3 外泌体（Exosomes）

外泌体是球形纳米大小的囊泡，是一类特殊的细胞外囊泡（EVs），直径为40～100 nm，密度为1.13～1.19 g/mL。在生理和病理条件下，外泌体均可通过几种细胞类型释放，包括免疫细胞，干细胞和肿瘤细胞。

通常，这些纳米大小的囊泡包含许多分子，包括核酸（例如双链DNA 和RNA 的各种亚型），蛋白质和脂质。重要的是，供体细胞释放的外泌体可以以自分泌、旁分泌或外分泌的方式被受体细胞吸收，这表明外泌体在细胞间通讯中的关键作用。在肿瘤环境中外泌体介导的交流影响了与肿瘤相关的途径，并促进了包括肺癌在内的多种癌症的发生和发展。肿瘤细胞外泌体在许多肿瘤生物学过程中起着重要作用。它们负责促进受体细胞的血管生成、侵袭和增殖，以促进肿瘤扩展和前转移生态位的形成。

与正常细胞相比，外泌体的形成在肿瘤细胞中显著改变。此外，尽管外泌体从所有细胞类型中释放出来，但外泌体在肿瘤细胞中高度丰富。在肺癌患者中，发现体液中的外泌体水平上调，表明外泌体在肺癌发展和进程中的关键作用。

与其他液体活检方法（如CTC 和ctDNA）相比，外泌体更可能反映细胞间通讯的作用，此外与CTC（1-10 CTC/mL血液）相比，肿瘤细胞外泌体释放是一个活跃的过程，血液中的泡数≥109个/mL，此外外泌体还敏感地反映肿瘤的状态，从而使外泌体更好地替代肿瘤的液体活检。尽管基于外泌体的肺癌液体活检策略在临床应用中具有很大的潜力，但在目前阶段，还是存在一些局限性，应将机制研究和临床研究更好地结合起来。

4 肿瘤培养血小板

液体活检的另一类新成分是肿瘤培养血小板（TEP）。这些无核的细胞碎片在外周血中形成第二种最丰富的细胞类型，可以通过转移与肿瘤相关的生物分子（主要是RNA）来受肿瘤细胞的教育。TEP 参与了多个实体肿瘤的进展和扩散，拼接的TEP-RNA 替代信号可以提供关于肿瘤存在、位置和分子特征的特定信息[5]。

传统上以止血作用著称的血小板在肿瘤的生长发育过程中也起着显著的作用。在与肿瘤细胞对抗的过程中，肿瘤相关分子可以转移至血小板内，最终形成TEP。

在癌症发生期间，血小板对癌细胞以及进入血液的癌细胞都有影响。首先，血小板通过向肿瘤提供多种促血管生成因子，如vegf、pdgf 和bfgf，并刺激这些因子的表达，创造支持新生血管形成的环境。其次，血小板减少局部肿瘤细胞凋亡和失活，并能通过直接的物理作用和释放TGF-β 分子诱导肿瘤细胞的上皮-间质转换。随后，血小板保护循环中肿瘤细胞免受正常免疫反应。心脏病患者使用的血小板聚集抑制剂，如氯吡格雷等，这些药物针对血栓形成所必需的受体（例如二磷酸腺苷受体），发现它们也主要通过调节肿瘤细胞/血小板相互作用和血管生成而影响导致癌症进展的机制。因此，血小板介导了肿瘤进展和癌症的全身扩散的关键步骤。

据报道，升高的预处理血小板、淋巴细胞比例与对nivolumab 抗PDL1 免疫疗法的应答率降低相关，表明在存在抗肿瘤免疫应答的情况下，循环中的血小板可能会增强促癌作用。有趣的是，还显示血小板可以浸润在肿瘤组织中，表明血小板可以连续地定植并从肿瘤微环境中疏散。

除了检测癌症外，还对TEP 进行了研究以监测癌症的进展。随着TEP 螯合肿瘤来源的RNA 分子，包括EML4-ALK融合转录本，已显示出有效的抗EML4-ALK crizotinib 治疗对NSCLC 患者降低了循环TEP 中EML4-ALK 转录本的数量。由于正常血小板的寿命约为7～10 d，因此肿瘤衍生的转录本可以在TEP 中积聚并受到循环血浆衍生RNA 酶的保护，因此可以预期TEP RNA 分析会揭示出高表达的肿瘤最新活动和反映其动态。已有研究表明，NSCLC 通过释放pf4 促进血小板生成，然后血小板进入肺和肿瘤实质。

较CTC，肿瘤血小板更加丰富。但是目前分析的样本数量相对较少，算法过度拟合的风险较高，获得TEP 的技术仍在发展。

5 展望

液体活检已经发展成为一个非常活跃的研究领域，尤其是CTC 和ctDNA 作为生物标志物受到了广泛的关注。尽管取得了重要进展，但液体活检的临床应用仍处于争论之中，一些技术挑战仍有待解决，其在早期癌症检测方面的应用仍然是一个巨大的挑战。总之，本文所述的各种液体活检平台可能在癌症患者的治疗中相互补充。连续地实时液体活检将有可能早期识别个体患者对癌症治疗的抵抗力，作为个体化癌症医学的重要标志。