细胞与组织冻存技术在女性生殖功能保存中的应用

王凤伟，陈岩，覃舒婷

（广西柳州市人民医院，广西 柳州）

随着现代医学技术的发展，许多癌症实现早期诊断，逐渐呈现出年轻化趋势。同时随着早期诊断、手术、放化疗等综合措施的跟进，癌症的生存率和治愈率有显著提高，很多癌症，比如乳腺癌等，在化疗、内分泌治疗过程中，会对女性生殖系统造成不可逆的损害，尤其乳腺癌患者如果对内分泌药物治疗不敏感，还需要做卵巢去势可能。利用胚胎、卵母细胞或卵巢组织的冷冻保存技术，可以保持这些癌症患者的生殖潜能。本文就细胞与组织冻存技术在女性生殖功能保存中的应用进行分析。

胚胎冷冻保存是全世界体外受精临床上公认的常规程序，是女性癌症患者未来获得生殖成功的最佳选择。然而，由于它需要精子来源，许多年轻的单身女性如不接受供精，则不能选择胚胎冷冻保存生育功能。此外，由于伦理、宗教和社会原因，获取胚胎和随后储存胚胎可能存在其他各种限制。在这些情况下，卵母细胞冷冻可能是更优的一种选择。美国生殖医学学会（ASRM）和美国临床肿瘤学会（ASCO）已将卵母细胞冷冻保存作为“癌症和其他需要治疗的疾病对妇女未来生育能力构成严重威胁的生育保护策略”[1]。然而，卵母细胞冷冻保存需要卵巢刺激，因此可能导致癌症治疗的延迟。

卵巢组织冷冻保存技术是保留生育功能另一重要方法，卵巢组织冻存不需要进行卵巢刺激，因此可以不用延迟治疗时间，尤其是对青春期前的女性也可适用。这种方法对卵巢组织（切片/碎片）进行超低温保存，可以储存大量原始卵泡和初级卵泡，在合适的时间进行冻存卵巢组织的再移植，以获取生育功能。来自四个欧洲医学中心进行的统计显示，这种卵巢自体移植术后妊娠率可达25%[2]。卵巢的自然可塑性有助于移植到不同的部位，在这些部位，卵巢可以重新血管化，并迅速恢复其正常生理。卵巢组织可以原位移植到骨盆或异位移植到皮下、肾及卵巢包膜或肌肉[3]。无论移植部位如何，卵巢移植都可能发生缺血和潜在的卵泡闭锁，这对该技术的成功提出了挑战。因此，在卵巢移植时，必须保证移植体与宿主组织之间有良好的细胞通讯。同时需注意的是，这种自体移植也可能存在再次引入癌细胞的风险。虽然确切的风险还不清楚，但癌症患者的尸检显示，不同癌症类型转移到卵巢的概率可达8.4%～55%[4]。目前研究显示，白血病患者在进行卵巢组织冻存自体移植后，再次引入恶性细胞的风险率最高，因此，患有盆腔或血液学恶性肿瘤的妇女可能不是卵巢组织移植的合适人选。为了规避这种风险，异种移植和卵母细胞体外成熟技术可能成为另外的选择。将冻融的卵巢组织移植到动物宿主体内，随后收集成熟卵母细胞，可以提供相当大的优势。通过这种技术，可以消除癌症传播和复发的可能性；有研究已经可以从异种移植的卵巢组织中获得M Ⅱ期卵母细胞[5]。如结合卵母细胞体外成熟技术的应用，似乎可为有需要的女性提供更多选择。

卵母细胞体外成熟相较卵母细胞冷冻保存可能具有一些优点，如不需要促排卵，同时消除了胚胎冷冻的宗教和/或其他伦理、法律和道德问题。未成熟卵母细胞可以从体内或体外获得，体内获得主要通过取卵技术，现多应用于多囊卵巢综合征患者，以降低卵巢过度刺激的发生率，目前应用该方法已经有许多健康分娩的报道[6]。从体外新鲜卵巢组织或冻存卵巢组织中获得未成熟卵母细胞主要适用于肿瘤患者，优点是可以防止癌细胞扩散，且避免了自体移植将肿瘤细胞再次引入体内的风险。2014 年，Prasath EB 等人首次通过对卵巢癌患者切除的卵巢中获得未成熟卵母细胞进行IVM 后冻存，后经体外受精胚胎移植获得活产[7]。

目前关于卵巢组织及细胞的冻存方法主要有传统的慢速冷冻和玻璃化冻存法。在传统的缓慢冷冻中，组织或细胞以可编程的方式缓慢冷却至约140 ℃，然后将组织放入196 ℃的液氮中用于储存[8]，但是，对于大组织切片或整个器官来说，由于组织核心及表面的非均匀的冷却速率，及细胞内冰晶的形成，容易造成严重的细胞损伤[9]，这种损伤可以通过提高表面体积比来减少，即需要尽可能小的样本，但对于冻存卵巢组织来说，过小的卵巢组织切片不利于保存大量的卵泡。同时也不适用于整个卵巢的保存。冻存前应用冷冻保护剂溶液能够能够穿透组织到足够的深度，防止冰晶形成的伤害，但解冻后，必须及时去除冷冻保护剂，因为一旦组织或器官处于生理温度，这些冷冻保护剂就可能对组织产生毒害作用。玻璃化冷冻是一种避免冰晶形成的过程，将组织或细胞暴露于高浓度的冷冻保护剂中，然后在-210 ℃的温度下迅速冷却至液氮中[10]，能够消除卵巢组织中形成冰晶的风险。玻璃化法与慢速冷冻法的不同之处在于冷冻保护剂的浓度（高）和冷却速度（快）。在对卵巢组织进行玻璃化冷冻和慢速冷冻，然后进行组织培养以评估随后的卵母细胞存活率的系统性比较中，两种方法卵母细胞存活率相似，但玻璃化冷冻可提高颗粒细胞存活率和基质完整性[11]。另一项研究提示，与慢速冷冻相比，对人囊胚的玻璃化冷冻有更高的复苏率和妊娠率[12]。虽然最初的数据显示卵巢组织玻璃化冷冻可能是更有利的方法，但在玻璃化冷冻取代慢速冷冻作为卵巢组织冷冻保存的标准方法之前，还需要进行更多的研究，尤其是高浓度的冷冻保护剂诱导细胞毒性和渗透性损伤和玻璃化安全性的问题。

总之，细胞与组织冻存技术在保留女性生育功能中发挥重要的、甚至不可替代的作用，也帮助了内分泌治疗不敏感的部分乳腺癌患者，让他们在选择卵巢去势治疗的同时，生育功能的需要得到保障。