SAA水平及其基因多态性分析在川崎病中的临床研究价值*

张 娟，陈 颖，易秀英，刘 飞，李 红，姚永明，纪 青

(株洲市中心医院儿科，湖南株洲 412000)

川崎病(KD)也称黏膜皮肤淋巴结综合征，其主要临床症状为持续性高热、口腔黏膜炎、结膜充血、手足硬性肿胀、多形性皮疹和非化脓性淋巴结肿大、手足蜕皮等[1]。KD是一种多系统血管炎，可以导致冠状动脉病变[2]，KD在低龄儿童中更为常见，大多数的KD发生在5岁以下，男性与女性的比例约为1.5∶1.0[3]。KD的病因尚不明确，随着分子遗传学的发展，许多研究集中于基因多态性与KD之间的关系。血清淀粉样蛋白A(SAA)是一种急性期蛋白和炎症标志物，在急性期早期，免疫系统被激活，由此异常活化的T淋巴细胞释放大量的炎性介质和细胞因子刺激肝脏合成SAA。SAA长期以来被认为是类风湿关节炎临床进展和预后的预测因子，也是冠状动脉疾病、心血管疾病预后和急性冠脉综合征早期死亡的预测因子[4]。在缺血性心肌病患者中，SAA水平明显升高，而扩张型心肌病患者中SAA水平升高程度不及缺血性心肌病患者[5]。近年来关于SAA在心血管疾病中的研究发现，SAA也可能作为大动脉炎的生物标志物[6-7]。本次研究旨在阐述KD中SAA水平变化，以及对SAA基因多态性与KD易感性及KD冠状动脉损伤之间的关联进行研究，了解SAA在KD发病机制中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016-2019年在株洲市中心医院住院的90例汉族KD患儿作为KD组，其中男58例，女32例，男女比例为1.8∶1.0，年龄为6月至5岁，平均年龄为2.75岁，所有患儿在采血前没有经过人免疫球蛋白(IVIG)及阿司匹林治疗；均符合KD诊断标准[8]。为进一步探究SAA基因多态性与KD冠状动脉损伤之间的关系，将KD组按照有无冠状动脉损伤分为KD合并冠状动脉损伤(KD-CAL组)和KD无冠状动脉损伤(KD-NCAL组)。冠状动脉损伤的诊断标准：左冠状动脉或右冠状动脉的内腔直径>3 mm(5岁以下儿童)，>4 mm(5岁及以上儿童)，或一段冠状动脉内径至少是相邻冠状动脉的1.5倍或冠状腔明显不规则。选取100例健康儿童作为对照组，无心血管疾病及既往无KD病史，其中男63例，女37例，男女比例为1.7∶1.0，年龄为6月至5岁，平均年龄为3.48岁，对照组及KD组性别比例比较，差异无统计学意义(χ2=0.043，P=0.836)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1SAA检验方法 采用深圳市国赛生物技术有限公司提供的SAA定量试剂盒(散射免疫比浊法)测定SAA水平(>10 mg/L为异常)，按试剂说明进行操作；KD患儿入院后，在使用IVIG及阿司匹林前后分别空腹采集静脉血2 mL，对照组儿童空腹采取静脉血2 mL，分次检验。

1.2.2DNA提取和基因多态性检测 应用Promega DNA提取试剂盒，提取血液DNA，按照说明书进行操作。检测水平和纯度后置于-20 ℃冰箱保存，选择SAA1基因多态性位点rs12218和SAA2基因多态性位点rs2468844检测，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增基因，使用引物的序列为rs12218上游引物：AGTGGATGGTAGGAGTGAGTGA，下游引物：TACTTTGTGGTATAGACTGCCTGT。rs2468844上游引物：ATGCCATATCTCAGCTTCTCTGGAC，下游引物：GGAGGAGTGAAAACACTGACCC(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。PCR的反应体系为25 μL：T3 Super PCR混合液22 μL(北京擎科生物技术公司)，上游引物1 μL(北京擎科生物技术公司)，下游引物1 μL(北京擎科生物技术公司)，DNA 1 μg。PCR的反应条件如下，rs12218：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，35个循环，72 ℃终末延伸2 min，4 ℃保存。rs2468844：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，61 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，35个循环，72 ℃终末延伸2 min，4 ℃保存。反应在PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)上进行。扩增产物送到测序公司(上海铂尚生物技术有限公司)进行基因测序。测序结果在Chromas软件(澳大利亚Technelysium公司)中进行阅读分析。

2 结 果

2.1KD组临床资料 在KD组中，发热90例(100.0%)，皮疹68例(75.6%)，球结膜充血41例(45.6%)，草莓舌69例(76.7%)，颈部非化脓性淋巴结肿大70例(77.8%)，手足硬肿50例(55.6%)，指端脱皮61例(67.8%)，肛周脱皮50例(55.6%)，冠脉损伤25例(27.8%)。

2.2KD组与对照组SAA水平比较 KD患儿SAA水平治疗前为(434.72±168.50)mg/L，治疗后为(20.23±7.11)mg/L，差异有统计学意义(t=9.548，P<0.01)，治疗前KD组与对照组SAA水平[(3.83±2.60)mg/L]比较,差异均有统计学意义(t=9.619，P<0.01)。

2.3SAA基因PCR产物图 SAA1基因rs12218位点的扩增产物片段为525 bp，SAA2基因rs2468844位点的扩增产物片段为380 bp，扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳分离，见图1、2。基因直接测序法测序结果见图3、4。SAA1基因rs12218位点的基因型和等位基因频率在对照组和KD组的分布经Hardy-Weinberg吻合度检测差异无统计学意义(χ2=1.66、5.76，P>0.05)。SAA2基因rs2468844位点的基因型和等位基因频率在对照组和KD组的分布经Hardy-Weinberg吻合度检测差异无统计学意义(χ2=0.15、0.66，P>0.05)。结果与预期一致。

注：M为DNA Marker；1、2、3为SAA1基因位点rs12218PCR产物。图1 SAA1基因位点rs12218 PCR产物凝胶电泳

注：M为DNA Marker；1、2、3为SAA2基因位rs2468844 PCR产物。图2 SAA2基因位点rs2468844 PCR产物凝胶电泳

注：A为TC基因型；B为TT基因型；C为CC基因型。图3 SAA1rs12218位点基因测序图

注：A为TC基因型；B为TT基因型。图4 SAA2 rs2468844位点基因测序图

2.4SAA1rs12218位点基因型及等位基因分布 SAA1rs12218位点的TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD-CAL组与KD-NCAL组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 SAA1rs12218基因型及等位基因分布与KD易感性的关系(n)

2.5SAA2rs2468844位点基因型及等位基因分布 SAA2rs2468844位点的TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD组和对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。TT、TC、CC基因型分布与T、C等位基因在KD-CAL组与KD-NCAL组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 SAA2rs2468844基因型及等位基因分布与KD易感性的关系(n)

3 讨 论

KD好发于5岁以内的幼儿，是一种以全身性中、小血管炎为主要病变的急性发热出疹性疾病，是儿童后天性心脏病最常见的病因之一[9]，其发病机制及病因不明。

SAA是一种急性时期蛋白，在机体发生炎症时其水平快速上升，是目前最敏感的炎症标志物之一，近期研究发现SAA水平与冠心病、脑出血等心血管疾病的严重程度及其炎性反应呈正相关[10-11]。高水平的SAA可能通过升高C反应蛋白(CRP)、纤维蛋白原、白细胞介素(IL)-6水平或降低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平在冠心病中发挥作用[10]。许多炎性因子，包括细胞因子、趋化因子、急性期反应物(如CRP、SAA)在KD中明显升高，提示SAA有可能参与了KD的发生机制[12]。KD患儿SAA、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的改变与其出现血管炎性反应、冠状动脉损伤有关[13]。本研究结果表明，SAA水平在KD患儿急性期明显升高，使用IVIG后水平迅速下降，KD患儿SAA水平在使用IVIG前后均较对照组更高。由此可说明，SAA可能参与了KD的发生过程，SAA作为新的炎症因子，SAA水平在KD治疗前后的变化，提示炎症参与了KD病程，与既往研究中SAA水平的监测有助于监测KD疾病评估疗效这一结论一致[13-14]，SAA可能作为诊断KD的早期诊断指标。

KD是一种可能与遗传易感有关的全身性血管炎综合征，目前已有研究发现，家族中既往亲属有KD病史的儿童KD患病率相应增加[15]。 SAA可在单核/巨噬细胞、内皮细胞中诱导促炎和促血栓形成介质的表达，并诱导内皮细胞功能障碍，在动脉粥样硬化中SAA有促进炎症的作用[16-17]，炎症早期SAA通过诱导基质金属蛋白酶导致斑块失稳，促使血栓事件的发生；SAA遗传基因多态性与心血管疾病相关，SAA基因位点(SAA1rs12218)突变与冠心病及其预后结局相关[18-19]，SAA1rs12218 CC基因型是脑梗死的独立危险因素[20]；SAA基因多态性(SAA1rs12218及SAA2rs2468844)基因突变在心肌梗死、颈动脉内膜中层厚度(IMT)增厚等疾病中可能起到遗传学标志物的作用[21]，而SAA1rs12218 CC基因使汉族冠心病的风险增加[22]。本研究选择SAA1rs12218位点、SAA2rs2468844位点，探讨其多态性与KD及KD冠状动脉损伤的关系。

本研究结果显示，KD患儿SAA1rs12218位点基因型分布与等位基因分布与健康儿童比较，差异无统计学意义(P>0.05)，SAA2rs2468844位点基因型分布及等位基因分布与健康儿童相比，差异无统计学意义(P>0.05)，KD无冠状动脉损伤患儿SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点基因型分布及等位基因频率与KD合并冠状动脉损伤患儿比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此，本研究尚未发现 SAA1rs12218、SAA2rs2468844位点与KD及其冠状动脉损伤的发生存在相关性。

4 结 论

本研究通过监测SAA水平在KD病程的变化，初步发现SAA水平可能有助于监测KD病程，可能有助于KD的早期诊断。此外，笔者发现SAA基因多态性(SAA1rs12218位点和SAA2rs2468844位点)与KD遗传易感关联性不强，也可能与本研究样本量不够大有关。因此，仍然需要多个中心和大量样本研究，以进一步揭示SAA基因多态性和KD之间的关系。