不同来源菌株中8种mcr亚型基因筛查及阳性菌株药敏分析*

2020-12-25赖斯华黄欢欢谢闺娥曾文创

国际检验医学杂志 2020年24期

赖斯华，黄欢欢，谢闺娥，曾文创，杨羚，徐霞△

(1.广州医科大学金域检验学院，广东广州 510030;广州医科大学第一附属医院:2.呼吸疾病国家重点实验室;3.检验科,广东广州 510030)

近年来，我国所面临的革兰阴性杆菌耐药问题尤为严峻，包括产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肠杆菌科细菌、耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌等[1]。其中，为治疗耐碳青霉烯类肠杆菌，多黏菌素重新进入临床使用，其成为治疗耐碳青霉烯类菌株的“最后一道防线”。过去认为，黏菌素的耐药是由染色体相关基因突变引起的，其耐药性不能在细菌间传播。然而，2015年中国学者LIU等[2]首次发现质粒携带黏菌素耐药基因mcr1，证实了黏菌素的耐药性也可以通过质粒在不同菌属间进行水平传播，治疗耐碳青霉烯类菌株的最后一道防线被打破，给临床治疗感染提出了巨大的挑战。

从mcr1基因开始被报道至2019年4月，共发现了7种mcr1的变异体，分别为mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8[3]。目前，mcr亚型基因在肠道菌群中和在耐碳青霉烯菌株中的流行率尚不明确。本研究通过筛查住院患者和体检人群的粪便标本中耐黏菌素菌株中mcr亚型基因的携带情况，以及临床分离标本中耐碳青霉烯菌株中mcr亚型基因的携带情况，比较不同标本中mcr亚型基因的流行情况，并探究携带mcr基因的菌株与黏菌素及碳青霉烯类药物的耐药表型之间的关系。

1 材料与方法

1.1菌株来源粪便菌株为2017年6-10月广州医科大学附属第一医院的住院患者1 263份粪便标本分离的92株耐黏菌素菌株及广州金域体检中心体检的750份粪便标本分离的36株耐黏菌素菌株(黏菌素耐药：≥2 mg/L)，同时保存患者的临床资料(包括性别、年龄、就诊科室、病史)。临床分离菌株为广州医科大学附属第一医院检验科微生物室2017年1月至2018年7月的痰、尿液、分泌物等临床标本。对每一份标本同时进行3种碳青霉烯类药物的药敏实验，收集和保存厄他培南(耐药:≥2 mg/L)、亚胺培南(耐药:≥4 mg/L)和美罗培南 (耐药:≤19 mm)其中一种或以上碳青霉烯类药物耐药的菌株，共得到130株耐碳青霉烯菌株，收集菌株的同时记录患者临床资料(科室、年龄、性别、分离日期等)。大肠埃希菌J53由广州医科大学附属第一医院检验科惠赠。

1.2仪器与试剂 LB肉汤干粉、麦康凯琼脂粉、营养琼脂购自广州环凯微生物公司；PCR及电泳相关制品购自广州瑞真生物技术有限公司；电泳琼脂糖购自法国Biowest公司；所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR仪购自美国Bio-Rad公司；G:BOX凝胶成像系统购自英国Syngene公司。

1.3方法

1.3.1细菌基因组DNA提取挑取单菌落用5 mL的LB液体培养基培养，180 r/min，37 ℃摇菌6 h。参照QIAamp DNA 小提试剂盒使用说明书提取细菌基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.2耐药基因筛查用PCR法对138株耐黏菌素的粪便分离菌株和130株耐碳青霉烯的临床分离菌株进行mcr基因(mcr1、mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8)的特异性引物筛查，具体的引物参考国外相关文献[3-5]合成，见表1。特异性筛查mcr1为阳性的菌株用全长序列(1 626 bp)的扩增引物MCR-F(5′-ATGATGCAGCATACTTCTGTGT-3′)及MCR-R(5′-TCAGCGGATGAATGCG-3′)进行扩增，将产物送至上海生工生物工程股份有限公司测序，并进行BLAST比对证实扩增产物基因的正确性。此外，对含mcr基因的阳性菌株进行11种碳青霉烯酶基因扩增(blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaAIM、blaDIM、blaGIM和blaSIM)[6]，确定碳青霉烯酶基因是否存在。

表1 8种mcr基因的特异性筛查引物

1.3.3菌株鉴定及药物敏感试验按照质谱仪及法国生物梅里埃VITEK-2药敏分析系统操作说明书进行细菌鉴定和药敏分析。抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)试验用微量肉汤稀释法，结果参照美国临床和实验室标准协会(CLSI) M100-S26标准判读，黏菌素的药敏折点参照EUCAST7.0版判读标准(敏感:≤2 mg/L)。

1.3.4质粒接合实验用mcr1基因阳性菌株作为供体菌，大肠埃希菌J53作为受体菌，接合前进行供受体菌的抗性验证。能在双抗培养基(含2 mg/L黏菌素及150 mg/L叠氮钠)生长的为接合子，挑取单个菌落在双抗培养基中传代培养3代，获得稳定传代的接合子。用PCR法验证接合子中mcr1基因的存在。

1.3.5质粒复制子分型用基于PCR的质粒复制子分型法对肠杆菌科细菌中18个主要质粒家族复制子(HI1、HI2、I1/Iγ、X、L/M、N、FIA、FIB、W、Y、P、T、FIC、A/C、FIIs、K、B/O、F)[7]进行检测，并增加对IncX1-IncX4[8]的检测。用以上质粒复制子引物对mcr1基因阳性菌株进行PCR扩增，产物测序后比对得出相应的复制子类型。

1.3.6毒力基因检测用特异性PCR法，对mcr1阳性大肠埃希菌进行12种毒力因子的检测(stx1、stx2、eae、hlyA[9],fyuA、iutA、sfa/foc、ibeA、fimH、cnf-1、papC和 kpsMTⅡ[10])。

2 结果

2.1耐药基因筛查 128株耐黏菌素的粪便标本分离株中(92株来自住院患者和36株来自体检人群)筛查mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8共7种mcr亚型基因，均未发现阳性基因。

130株耐碳青霉烯菌株筛查mcr1、mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8共8种mcr亚型基因，发现1株mcr1阳性菌株——A57号菌株。经mcr1全长序列扩增并BLAST比对后，相似性为100%，确证A57号携带mcr1阳性基因，PCR结果见图1。对mcr1阳性的菌株A57进行11种碳青霉烯酶基因扩增，未发现碳青霉烯酶阳性基因。

注：A为mcr1基因502 bp特异性片段扩增电泳图；B为mcr1基因全长序列1 626 bp扩增电泳图。图1 PCR扩增电泳图

2.2mcr阳性菌株鉴定及药物敏感试验 A57号菌株经质谱鉴定为大肠埃希菌。如表2所示，其药敏结果显示对黏菌素的MIC为2 mg/L，判读为中介，ESBLs检测阳性，并对19种药物表现出耐药差异性，对头孢类、青霉素类、喹诺酮及磺胺类药物等12种药物表现出耐药性(58%，11/19)，其中对一、二、三、四代头孢类药物表现出耐药性(88%，8/9)。

表2 携带mcr1基因的大肠埃希菌药物敏感试验结果

2.3质粒接合 mcr1基因阳性的菌株质粒接合成功，获得稳定传代的接合子，PCR验证接合子中含有mcr1基因，即mcr1基因存在于质粒上，并能通过质粒转移。

2.4质粒复制子分型与毒力基因检测 mcr1基因阳性菌株携带6种质粒，分别为IncFIB、IncFIC、IncA/C、IncI1、IncFrepB、IncX4。mcr1基因阳性菌株携带3种毒力基因，分别为编码Ⅰ型菌毛黏附素的基因fimH、与铁摄取相关的气杆菌素受体的基因iutA、与荚膜形成相关的基因kpsMTⅡ。

3 讨论

mcr1基因的发现证实黏菌素的耐药性可通过质粒在不同种属的细菌间进行水平传播，黏菌素耐药率可迅速提高，因此，自2015年来，国际上掀起了研究mcr基因的热潮。在很短的时间内，mcr1基因已经在6个大洲(除南极洲)的18个国家中被发现。迄今为止，除了mcr1以外，关于mcr2～mcr8基因在人类样本中流行情况的数据较少。中国香港一家医院收集2016年的672份粪便标本，检测出14株mcr1基因阳性大肠埃希菌[11]。苏州一家医院收集了134例接受不孕不育评估女性的阴道拭子标本，其中mcr4基因检出率为12.7%，mcr3和mcr2基因检出率均为15.0%，mcr1和mcr5基因检出率为0.7%[12]。在另外一项国内的研究中发现，mcr3基因在猪和农民中的检出率为0.75%，分布于13个省，广东省发现2例农民携带mcr3基因[13]。8种mcr亚型基因在人类身上的流行率尚十分不明确，本研究选取了mcr1流行率高的肠道细菌来探究mcr亚型基因的流行情况。

在收集的耐黏菌素菌株中，前期研究已经发现3株mcr1基因阳性菌株[14]。本研究在128份耐黏菌素粪便标本中均没有检出mcr2、mcr3、mcr4、mcr5、mcr6、mcr7、mcr8这7种亚型基因，说明除mcr1基因外，其余mcr亚型基因在肠道菌群中流行率非常低。在耐碳青霉烯类药物的130份临床感染标本中，发现1例由痰标本分离得到的mcr1基因阳性的大肠埃希菌菌株A57号(0.76%)，但没有检出其余7种mcr亚型基因，说明耐碳青霉烯菌株中mcr的流行率不高。在我国的临床标本中还是以mcr1基因为主，其次为mcr2、mcr3和mcr4，mcr5、mcr6和mcr7比较少见，但由于旅游人员及动物的流通，仍需动态观察我国mcr亚型基因的流行情况，以防mcr的大规模流行，使治疗陷入无药可用的局面。

黏菌素被认为是用于治疗耐碳青霉烯菌株的有效药物,mcr1基因与碳青霉烯耐药基因同时存在,这成为全球的一大关注点。本研究中，mcr1基因阳性的大肠埃希菌尽管没有筛查到碳青霉烯酶基因，但该菌株对碳青霉烯类药物耐药的同时也对黏菌素耐药，这使临床上可选择的治疗药物大大减少。本研究中mcr1基因阳性的大肠埃希菌产ESBLs,该菌株几乎对所有的头孢类药物耐药：对一、二代头孢类药物均耐药，三代头孢类药物中只对头孢哌酮敏感。IncX4、IncI1型质粒为常见的质粒型传播mcr1基因。质粒接合实验证实mcr1基因可以通过水平方式转移到大肠埃希菌J53中，说明mcr1基因在肠杆菌科细菌之间存在潜在传播的风险。WANG等[15]从养鸡场、农场、废水、苍蝇、屠宰场和超市中分离的细菌中检测到mcr1 基因，这说明mcr1基因已经广泛存在于人类生活的环境中，成为细菌感染治疗中的巨大隐患。