基于气相色谱-质谱的拟靶向代谢组学方法分析大米中脂肪酸

王希越,明 明,连丽丽,张 浩,娄大伟

(化学与制药工程学院,吉林化工学院,吉林 吉林 132022)

水稻是世界最主要的粮食作物之一,在我国种植面积广泛,而且我国有一半以上的人口都是以大米作为主食。大米具有较高的营养价值,其含有丰富的碳水化合物、维生素及少量蛋白质、脂肪等[1]。大米中脂肪含量虽然不多,但其是影响大米营养价值及品质的重要因素。有研究发现,脂类氧化造成游离脂肪酸含量增加,进而导致大米陈化、变质[2,3]。另外大米中含有人体所必需的几种脂肪酸,包括亚油酸、亚麻酸、油酸等,这些物质不仅是种子的营养物质,而且具有重要的医疗价值。研究发现,亚油酸、亚麻酸对防治动脉硬化、糖尿病及心脑血管疾病的发生具有重要作用[4-6],而且不饱和脂肪酸含量有助于提高大米的香味,改善其整体质量[7],因此大米中脂肪酸的分析对其品质和营养价值研究有重要作用。

脂肪酸分析一般通过Folch方法、索氏萃取法、蒸馏萃取法等提取后甲酯化衍生,再用气相色谱-质谱进行检测分析[8-10]。Folch方法中氯仿毒性大,对环境及人体有较大危害,另外索氏萃取法、蒸馏萃取法也需消耗大量有机溶剂。近年来有研究[11-13]提出原位转酯化方法,可同时实现脂肪酸提取及甲酯化衍生。该方法操作简单省时,有较好的提取效率及准确性,且消耗有机溶剂少,不需要使用氯仿等。詹汉英等[13]建立了一步提取衍生方法对猫爪草中的脂肪酸进行分析,以正己烷做提取溶剂,提取衍生8 min,得到脂肪酸总量明显高于传统方法。

气相色谱-质谱是目前常用的脂肪酸检测方法,通过选择离子监测(SIM)的靶向分析方法可提高定量检测的灵敏度和准确性,但是方法的建立需要标准物质[14]。2012年,Li等[15]提出保留时间锁定GC-SIM-MS拟靶向代谢组学方法,并将其用于不同产地烟叶中代谢物的差异分析。随后,利用多反应监测(MRM)模式的超高效液相色谱-三重四级杆质谱(UHPLC-QQQ-MS)的拟靶向代谢组学方法被发展起来[16],这类方法兼具有靶向和非靶向分析方法的优势,而且方法建立不需要标准物质,在疾病、植物等领域得到了广泛应用[17-20]。该实验基于气相色谱-质谱技术,通过不同提取方法及提取溶剂的考察优化,建立了原位提取衍生-拟靶向方法用于大米中脂肪酸分析,并用其研究5种大米中脂肪酸轮廓差异。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B气相色谱(美国Agilent公司);M7-300EI质谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司);XMHS2144水浴恒温振荡器(天津欧诺仪器仪表有限公司);XW-80A微型涡旋混合仪(上海泸西分析仪器有限公司);低速台式离心机(金坛市科析仪器有限公司);H1650高速台式离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司);CPA225D精密电子分析天平(德国赛多利斯);N-EVAP 111氮吹仪(美国Organomation Associates公司)。

正己烷(分析纯)购自辽宁泉瑞试剂有限公司;丙酮(分析纯)购自天津东方化工厂;二氯甲烷(分析纯)购自沈阳市华东试剂厂;甲醇(色谱纯)购自美国Tedia公司;异丙醇(色谱纯)购自沈阳市华东试剂场;三氯甲烷(分析纯)购自天津市北方天医化学试剂厂;氢氧化钾(分析纯)购自天津市永大化学试剂有限公司。5种水稻(稻花香、吉星、金浪子、农大、状元)采自长春市某乡镇稻田。

1.2 实验方法

1.2.1大米前处理

将5种水稻种子脱壳处理得大米后,用粉碎机粉碎,过60目筛子,于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2提取

分别称取1 g上述粉碎后的稻花香、吉星、金浪子、农大、状元大米样品，混合均匀,制成质量监控(QC)样品用于方法建立及考察。称取100 mg QC样品,置于玻璃管中,加入1 mL正己烷,分别用6种方法进行脂肪酸提取衍生。

恒温振荡提取同时衍生:向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)0.25 mL,于30 ℃恒温水浴振荡1 h,再加入0.25 mL 2 mol/L盐酸溶液,涡旋1 min,以3 000 r/min离心10 min,取700 μL上清液,氮气吹干,用100 μL正己烷溶解后进行GC-MS分析。

摇床振荡提取同时衍生:向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)后,于30 ℃以200 r/min摇床振荡提取1 h,其他操作同恒温振荡提取同时衍生。

涡旋振荡提取同时衍生：向正己烷溶液中加入甲醇溶液(含2 mol/L KOH)后,涡旋提取5 min,其他操作同恒温振荡提取同时衍生。

恒温振荡提取后再衍生:将正己烷溶液于30 ℃恒温水浴中振荡1 h,以3 000 r/min离心10 min,取800 μL上清液氮气吹干,然后加入1 mL正己烷涡旋30 s,再加入0.25 mL甲醇溶液(含2 mol/L KOH),涡旋5 min,再加入0.25 mL 2 mol/L盐酸溶液,涡旋1 min,混匀。以20 000 r/min离心10 min,取900 μL上清液用氮气吹干,用100 μL正己烷溶解后进行GC-MS分析。

摇床振荡提取后再衍生:将正己烷溶液于30 ℃以200 r/min摇床振荡1 h,以3 000 r/min离心10 min,取800 μL上清液氮气吹干。脂肪酸甲酯化衍生同恒温振荡提取后再衍生。

涡旋振荡提取后再衍生:将正己烷溶液涡旋提取5 min,以3 000 r/min离心10 min,取800 μL上清液氮气吹干。脂肪酸甲酯化衍生同恒温振荡提取后再衍生。

1.2.3GC-MS条件

色谱柱为安捷伦HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);柱温箱的起始温度设定为150 ℃,然后以20 ℃/min的速率升至214 ℃,再以10 ℃/min的速率升至280 ℃,保持10 min。使用高纯氦气作载气,其线速度为1.2 mL/min;进样口温度设定为260 ℃;传输线温度设定为280 ℃;分流比为10∶1;溶剂切割时间为2.0 min。

离子源为电子轰击源,温度设定为230 ℃;全扫描范围为m/z33～500。选择离子扫描时间为2.0～5.8 min,扫描离子为m/z69.0、74.0、87.0、242.0、256.0;扫描时间为5.8～6.9 min,扫描离子为m/z67.0、69.0、74.0、294.0、296.0;扫描时间为6.9～12.5 min,扫描离子为m/z69.0、74.0、87.0、324.0、326.0;扫描时间为12.5～19.0 min,扫描离子为m/z74.0、87.0、143.0、368.0、382.0。

1.2.4数据处理

将300 mg QC样品提取衍生,进样分析后获得全扫描数据。将仪器采集的原始数据转化成netCDF格式,导入AMDIS进行去卷积、峰检测和鉴定。代谢物鉴定主要利用NIST、Mainlib谱库检索,并结合保留指数加以确认。特征离子也通过AMDIS峰检测获得。最终得到每个脂肪酸保留时间和特征离子表格用于SIM扫描方法建立。

GC-MS采集数据经ChemStation进行色谱峰积分,得到包括每种脂肪酸的保留时间和峰面积的二维峰表。数据经总面积归一化,导入SIMCA-P 14.0进行主成分分析(PCA);数据经UV归一化后,用MeV4.9.0进行热图分析;折线图用Origin 9.0软件绘制。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

QC样品经6种提取方法提取分析,分别得到的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的总响应强度(见图1)。可以明显看出,不论饱和脂肪酸还是不饱和脂肪酸,采用恒温振荡提取同时衍生方法得到的总强度都是最高的。因此选取恒温振荡提取同时衍生方法用于处理后续样品。

图1 不同提取方法对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸响应的影响(n=3)Fig.1 Effect of different extraction methods on the intensities of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids (n=3) 1.derivation and extraction simultaneous by isothermal oscillation;2.derivation and extraction simultaneous by shaker oscillation;3.derivation and extraction simultaneous by vortex oscillation;4.derivation following extraction by isothermal oscillation;5.derivation following extraction by shaker oscillation;6.derivation following extraction by vortex oscillation.

2.2 提取溶剂的选择

本实验称取100 mg QC样品,分别加入4种提取溶剂(正己烷、正己烷-丙酮(4∶1,v/v)、正己烷-二氯甲烷(4∶1,v/v)和正己烷-异丙醇(3∶2,v/v)),利用恒温振荡提取同时衍生方法提取脂肪酸,考察不同提取溶剂对脂肪酸提取效率的影响。结果如图2所示,采用正己烷提取时,饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的相应强度均最大。因此后续实验采用正己烷作为提取溶剂。

图2 不同提取溶剂对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸响应强度的影响(n=5)Fig.2 Effect of the different extraction solvents on the intensities of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids (n=5)

2.3 拟靶向分析方法建立

为避免丢失低丰度物质信息,实验使用300 mg QC样品建立拟靶向分析方法,得到典型离子流色谱图(见图3)。该方法共检测到16种脂肪酸,分别为C14∶0、C15∶0、C16∶1、C16∶0、C17∶1、C17∶0、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶1、C20∶0、C22∶1、C22∶0、C23∶0、C24∶0和C26∶0。

图3 QC样品中16种脂肪酸的总离子流色谱图Fig.3 TIC chromatogram of the 16 fatty acids in the quanlity control (QC)sample

图4为C26∶0、C17∶1、C17∶0 3种脂肪酸在全扫描模式(full scan)和SIM模式下的色谱图。基于SIM扫描的拟靶向分析方法比传统的非靶向分析方法具有更好的灵敏度,可用于大米中脂肪酸的准确定量分析。

图4 C26∶0、C17∶1、C17∶0在选择离子扫描模式和全扫描模式下的色谱图Fig.4 Chromatograms of C26∶0,C17∶1,C17∶0 in SIM and full scan modes

2.4 重复性考察

选取正己烷作为提取溶剂,用恒温振荡提取同时衍生方法对QC样品中的脂肪酸进行提取,平行处理8份样品,以每种脂肪酸峰面积的相对标准偏差考察方法的稳定性,16种脂肪酸相对标准偏差均小于10%,由此说明该方法稳定性较好。

2.5 方法应用

基于所建立的方法对稻花香、吉星、金浪子、农大、状元5种大米中的脂肪酸进行提取,采集谱图信息经数据处理后,得到脂肪酸二维峰表,总面积归一化后导入SIMCA-P,UV标尺化后进行PCA模型识别分析。图5显示了5种大米样品的PCA得分图,其中，R2X=0.867,Q2=0.8,R2X代表PCA模型中主成分解释变量占总变量的百分比,Q2代表根据交叉验证PCA模型预测的训练集中变量百分比,说明该模型有较好的解释和预测能力。从图中可以看出，稻花香大米与其他4种在主成分2(t[2])上区分明显,说明彼此之间脂肪酸轮廓差异较大;而金浪子、吉星、状元和农大在主成分1(t[1])上有明显区分,尤其是金浪子和农大间差异较大,说明金浪子中脂肪酸轮廓与农大中有较大不同。

图5 5种大米样品的主成分分析得分图Fig.5 Principal component analysis (PCA)score plot of the five rice samples

为了更明显地看出5种大米中脂肪酸轮廓差异,16种脂肪酸热图见图6。从图6可以清晰地看到,稻花香大米中脂肪酸轮廓明显不同于其他4种,金浪子和农大、状元间脂肪酸轮廓差异也较大,除C22∶1,大部分脂肪酸在金浪子中含量均较少,而农大和状元中大部分脂肪酸含量均高于其他3种。

图6 5种大米样品中脂肪酸的热图Fig.6 Heat map of the fatty acids in the five rice samples

3 结论

本实验基于GC-MS平台建立了拟靶向代谢组学分析方法研究大米中脂肪酸轮廓。该方法不需要购买标准物质,相对于经典的全扫描模式下非靶向代谢组学方法,有较好的灵敏度,可实现样品中低丰度物质的准确定量分析。将该方法用于5种大米样品中脂肪酸分析,可准确获得各样品间脂肪酸轮廓差异信息,可为今后研究脂肪酸对大米营养价值及品质改善的影响奠定基础。