气相色谱正构烷烃和直链脂肪酸甲酯两种线性保留指数之间的转换方法

李 勇,逄 涛,师君丽,邓小鹏,孔光辉,卢秀萍

(云南省烟草农业科学研究院,云南 玉溪 653100)

保留指数是气相色谱中用于化合物结构鉴定的重要手段,其对于区分质谱谱图类似的同系物和同分异构体具有重要意义。与保留时间不同,化合物的保留指数值在气相色谱柱固定相相同的情况下相对稳定[1,2],不同实验室得到的保留指数值具有可比性,而通过建立化合物的保留指数数据库,可以对质谱初步定性的化合物进行进一步验证。

Ervin Kováts最早提出恒温保留指数的概念,即Kováts保留指数[1]。但由于Kováts保留指数公式计算较复杂,且只适合于恒温分析,其应用范围受到限制。Van Den Dool等在Kováts保留指数的基础上开发出线性保留指数[3]。该指数计算公式简单,且适应于线性程序升温,因此在复杂体系分离分析中得到广泛应用。保留指数概念从提出开始就一直成为化合物结构鉴定的重要工具[4-9],随着代谢组学和质谱数据库的发展,保留指数作为辅助定性工具进一步得到广泛的应用[10-12]。

线性保留指数主要有基于正构烷烃[1,3]、直链脂肪酸甲酯[13]、多环芳烃等[14]3种计算方式,其中基于正构烷烃的线性保留指数是使用范围最广的保留指数。但正构烷烃保留指数在分析极性混合物[15]和包含大量烷烃的混合物[16]时效果较差。因此在代谢组学研究和生物燃料分析时,基于直链脂肪酸甲酯的保留指数得到广泛应用[16]。多环芳烃保留指数在分析多环芳烃时应用较多,而在其他方面应用较少。在实际应用中,正构烷烃保留指数和直链脂肪酸甲酯保留指数通常不同时出现在同一数据库中。例如,NIST数据库收录了大量的正构烷烃保留指数和少量lee保留指数[14],但未收录脂肪酸甲酯保留指数,而Fiehn代谢组学数据库则只列出了代谢物的脂肪酸甲酯保留指数[16]。因此如果两种保留指数之间存在确定的转换关系,就可在获得一种保留指数的同时得到另一种保留指数,从而确保化合物定性时不同保留指数数据库均可进行比对,增加化合物定性的可靠性。

本研究针对气相色谱常用的弱极性色谱柱和极性色谱柱开展正构烷烃保留指数和脂肪酸甲酯保留指数之间的转换关系研究,以期获得这两种保留指数之间的稳定转换关系。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 7890B气相色谱仪配5975质谱仪(美国Agilent公司),涡旋混匀器(荷兰Breda公司),CP2245分析天平(感量0.000 1 g,德国Sartorious公司)。弱极性色谱柱DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm,固定液为5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)和极性色谱柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm,固定液为聚乙二醇)购自美国Agilent公司。

0#柴油(含C8～C26正构烷烃)购于玉溪红塔区某加油站,C27～C32正构烷烃、C5～C24直链脂肪酸甲酯、二氯甲烷等标准物质和试剂购于百灵威试剂公司。

用于验证极性柱条件下正构烷烃保留指数和直链脂肪酸甲酯保留指数之间转换关系的第1至第24种化合物依次为丁酸甲酯、戊酸甲酯、己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、癸酸甲酯、十一烷酸甲酯、十二烷酸甲酯、十三烷酸甲酯、十四烷酸甲酯、十四碳烯酸甲酯(顺-9)、十五烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、十六碳烯酸甲酯(顺-9)、十七烷酸甲酯、十八碳酸甲酯、十八碳烯酸甲酯(反-9)、十八碳二烯酸甲酯(顺-9,12)、十九烷酸甲酯、二十烷酸甲酯、二十二烷酸甲酯、二十二碳烯酸甲酯(顺-13)、二十四烷酸甲酯。

1.2 样品前处理

将C27～C32正构烷烃和C5～C24直链脂肪酸甲酯用二氯甲烷稀释至1 mg/L。取10 μL 0#柴油和1 mL 1 mg/L C27～C32混合标样,置于1.5 mL色谱进样小瓶,均匀混合,以备GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析条件

GC条件 在色谱柱固定相确定的情况下,柱温是影响保留指数的主要因素[17],因此本实验中DB-5MS和DB-WAX两种色谱柱均设置4种程序升温条件。程序1:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序2:60 ℃保持1 min,以20 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序3:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至140 ℃,保持10 min,再以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;程序4:60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至100 ℃,保持10 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持10 min,再以5 ℃/min升至280 ℃,保持10 min。载气为氦气;柱流量为1.1 mL/min;分流比为20∶1,进样量为1 μL。

MS条件 溶剂延时为1.8 min。采用EI离子源;离子源温度为250 ℃;质量扫描范围为m/z35～450;质谱数据采集频率为2 Hz。

1.4 数据分析方法

化合物的质谱图提取和结构鉴定:采用AMDIS V 2.7进行色谱图去卷积和峰识别;化合物定性采用NIST MS Search 2.0配NIST 2017数据库。对正构烷烃序列,采用m/z43、57、71等离子以及化合物的分子离子辅助定性。对直链脂肪酸序列,采用m/z74、87离子以及化合物的分子离子辅助定性。文献保留指数来自NIST 2017数据库、Fiehn代谢组学数据库和GOLM代谢组学数据库,凡是固定相类型相同的线性文献保留指数均纳入文献保留指数统计范围。

表1 弱极性柱上不同程序升温条件下直链脂肪酸甲酯系列化合物的烷烃保留指数Table 1 n-Alkane-based retention indices (RIs)of n-fatty acid methyl esters acquired using a semi-standard non-polar column with different temperature programs

Four different temperature programs were set to demonstrate the correlation.Program 1 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 2 was set as 60 ℃,held for 1 min,20 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 3 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 140 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.Program 4 was set as 60 ℃,held for 1 min,5 ℃/min to 100 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 180 ℃,held for 10 min,5 ℃/min to 280 ℃,held for 10 min.

化合物保留指数按照线性保留指数计算方法[3]计算得到。即,保留时间介于碳数为n和n+1的正构烷烃之间的化合物x的线性保留指数计算公式如下:

(1)

其中,LRIx代表化合物x的烷烃线性保留指数,tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分别代表化合物x、第n个碳正构烷烃和第n+1个碳正构烷烃的保留时间。保留时间介于碳数为n和n+1的直链脂肪酸甲酯化物的脂肪酸甲酯线性保留指数的计算公式与公式(1)相同,只是式中LRIx代表化合物x的脂肪酸甲酯化线性保留指数,tR(x)、tR(n)、tR(n+1)分别代表化合物x、第n个碳直链脂肪酸甲酯和第n+1个碳脂肪酸甲酯的保留时间。

2 结果与讨论

2.1 复杂程序升温条件下保留指数计算公式的选择

Van Den Dool等定义了线性程序升温条件下保留指数的计算公式(公式(1))[3]。而在复杂体系分离分析过程中,线性程序升温条件通常无法达到最佳分离效果,因此使用复杂程序升温条件(通常由恒温步骤和不同或相同速率升温步骤组成)成为常态。复杂程序升温条件下保留指数的计算公式目前并未形成研究共识,因此NIST质谱数据库[18]、Fiehn代谢组学数据库[16,19]、Golm代谢组学数据库[20]等在数据采集时虽均采用了复杂程序升温条件,但在计算保留指数时均直接使用了Van Den Dool等的线性保留指数计算公式。本实验采用公式(1)计算了4种不同程序升温条件下的保留指数,发现在不同的程序升温条件下,采用该公式计算的保留指数确实存在区别,弱极性柱条件下获得的保留指数最大极差为5.9(见表1),而极性柱条件下最大极差为14.2(见表2)。由于在当前尚无成熟的用于复杂程序升温条件下的保留指数计算公式,且主流保留指数数据库均采用了公式(1)计算复杂程序升温条件下的保留指数,本研究也同样采用公式(1)用于所涉及的保留指数计算。

表2 极性柱上不同程序升温条件下直链脂肪酸甲酯系列化合物的烷烃保留指数Table 2 n-Alkane-based RIs of n-fatty acid methyl esters acquired using a standard polar column with different temperature programs

The temperature programs were the same as those in Table 1.

2.2 弱极性柱上两种保留指数之间的关系

将C8～C32正构烷烃和C5～C24直链脂肪酸甲酯混合并上样至弱极性色谱柱,在不同的程序升温条件下分别记录烷烃序列和脂肪酸甲酯序列的保留时间,采用公式(1)计算甲酯序列的烷烃线性保留指数。将计算得到的脂肪酸甲酯的烷烃保留指数和其对应的甲酯化保留指数(根据公式(1),其值为碳数乘以100)进行线性拟合,结果见表1。从表1可以看出,不同温度程序下计算得到的保留指数变化很小,所得数据的相对标准偏差(RSD)在0.02%～0.20%之间,保留指数的极差在1.1～5.9之间,说明程序升温条件的变化对保留指数影响很小,不同程序升温条件下得到的保留指数之间具有可比性。将不同程序升温条件下得到的C5～C24系列脂肪酸甲酯化合物的烷烃保留指数求均值并将其与甲酯化保留指数进行一阶线性拟合,得到y=1.005 1x+318.51(r2=1,式中y和x分别代表烷烃保留指数和脂肪酸甲酯保留指数)。线性相关系数等于1说明这两种保留指数之间具有极强的相关性,因此在该弱极性柱上,只要得到某种化合物的烷烃保留指数,就可以根据y=1.005 1x+318.51公式计算得到该化合物的甲酯化保留指数,反之亦然。

2.3 极性柱上两种保留指数之间的关系

采用2.1节所述方法计算极性柱上直链脂肪酸甲酯序列的烷烃线性保留指数(见表2)并与其甲酯化保留指数进行线性拟合。从表2可以看出,不同温度程序下计算得到的保留指数变化很小,RSD在0.06%～0.29%之间,保留指数的极差在3.0～14.2之间,说明程序升温条件的变化对保留指数影响较小,不同程序升温条件下得到的保留指数之间具有可比性。将不同程序升温条件下得到的C5～C24系列脂肪酸甲酯化合物的烷烃保留指数求均值并将其与甲酯化保留指数进行一阶线性拟合,得到y=1.036 2x+562.519(r2=1,式中y和x分别代表烷烃保留指数和脂肪酸甲酯保留指数)。

2.4 转化效果验证

2.4.1弱极性色谱柱

Fiehn代谢组学数据库中收录了弱极性色谱柱(固定液为5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)上代谢物的甲酯化保留指数,但未采集正构烷烃保留指数。本实验对Fiehn代谢组学数据库中1 043个代谢物的甲酯化保留指数采用本实验所获得的转化公式y=1.005 1x+318.51进行计算,得到相应的正构烷烃保留指数。以质谱谱图为依据搜索NIST 2017主数据库和GOLM代谢组学数据库,得到300个代谢物及相应文献保留指数(其余代谢物在NIST 2017和GOLM数据库中不存在相应的质谱谱图或烷烃保留指数)。对得到的300个代谢物的计算烷烃保留指数和文献保留指数进行比较,结果发现分别有139个(46.3%)和245个(81.7%)个代谢物的计算保留指数与文献(最接近的)保留指数相差值小于5和10。另外有55个代谢物的计算保留指数与文献保留指数相差值大于10(见附表1,http://www.chrom-China.com)。

图1 弱极性柱下正十六烷酸甲酯的烷烃文献保留指数分布Fig.1 Distribution of n-alkane-based reference RIs acquired using semi-standard non-polar columns Shadow in the figure stands for average±standard deviation of the reference RIs listed in the NIST 2017 MS database.

虽然绝大部分(81.7%)被统计代谢物的计算保留指数与文献保留指数十分接近,但仍有部分计算保留指数与文献保留指数相差较大。其原因在于影响线性保留指数的因素较多。在固定相组成相同的情况下,载气流速、固定液厚度、程序升温条件、载气流量控制方式(恒流或恒压)、色谱柱尺寸等都可能对线性保留指数计算值产生一定的影响[2,21],虽然这些影响因素相对固定相组成的影响而言很小。因此,线性保留指数的文献记录不是一个确定值,而是一个分布范围。当文献保留指数记录较多时,本实验通过公式转换得到的保留指数与文献保留指数能较好地匹配,而当文献保留指数记录较少时,本实验获得的保留指数就有可能与文献值相差较大。例如,正十六烷酸甲酯在NIST 2017数据库中有137条弱极性柱(固定液为5%苯基和95%的甲基聚硅氧烷)文献保留指数记录(见图1),其均值为1 924.2,而本实验测定的该化合物的保留指数为1 925.6,采用Fiehn代谢组学数据库中该化合物的甲酯化保留指数通过本实验获得的转化公式计算得到的烷烃保留指数为1 922.4,三者十分接近。但在这137条文献保留指数记录中也有部分记录远离均值,如最小值1 894和最大值1 964。因此,当文献保留指数记录较少(例如只有1条)时,就有可能出现计算值与文献值相差较远的情况。本实验中,计算保留指数和文献保留指数差值大于10的55个代谢物中有43个仅有1条文献保留指数记录,其余12个代谢物的计算保留指数仅3条超出了文献保留指数分布范围(见附表1,http://www.chrom-China.com)。

图2 极性柱条件下脂肪酸甲酯系列化合物的烷烃文献保留指数和通过公式计算的保留指数Fig.2 Distribution of n-alkane-based RIs acquired from references and n-fatty acid methyl ester-based RIs using standard polar columns n-Fatty acid methyl ester-based RIs were converted to n-alkane-based RIs using the following equation:y=1.0362x+562.519,where x and y stand for n-fatty acid methyl ester-based and n-alkane-based RIs,respectively.Compounds 1 to 24 stand for methyl esters of n-fatty acids C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C14∶1 (cis 9),C15,C16,C16∶1(cis 9),C17,C18,C18∶1 (trans 9),C18∶2 (cis 9,12),C19,C20,C22,C22∶1 (cis 13),and C24,respectively.

2.4.2极性色谱柱

由于很多极性化合物可以在衍生化(例如硅烷化、甲酯化)后采用弱极性色谱柱进行分析,极性色谱柱的使用频率从总体上说小于弱极性柱。因此,基于极性色谱柱的文献保留指数记录也远小于基于弱极性柱的保留指数。本研究未找到一组化合物在极性柱分析条件下同时存在甲酯化保留指数和烷烃保留指数的文献保留指数。为了验证本实验获得的转化公式的正确性,将实验获得的脂肪酸甲酯系列化合物的甲酯化保留指数采用获得的转化公式(y=1.036 2x+562.519)进行转化,计算得到相应的烷烃线性保留指数,并将其与NIST 2017质谱数据库中相应的烷烃文献保留指数进行比较(见图2)。结果发现,公式计算得到的保留指数与相应的文献保留指数的均值十分接近,所有计算保留指数均处于文献保留指数均值加减方差范围内,且未发现计算保留指数超出文献保留指数分布范围的情况,说明采用此公式转化获得的保留指数具有很好的参考性。

3 结论

本研究获得了弱极性柱和极性柱条件下正构烷烃保留指数和脂肪酸甲酯保留指数之间的转换公式,利用文献保留指数对所获得的转换关系进行验证,发现弱极性柱和极性柱条件下获得的保留指数转换公式均能达到较好的转换效果。正构烷烃保留指数和脂肪酸甲酯保留指数之间转换公式的获得对利用化合物保留指数定性时扩大索库范围、减少保留指数采集实验具有重要意义。