茉莉茎段遗传转化体系初步研究

张 月，陈 风，卢 莹，袁 媛，陈清西

(福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002)

茉莉花(Jasminum sambac)是木犀科(Oleaceae)素馨属(Jasminum)常绿灌木[1]，广泛用于茉莉花茶的窨制、香料香精、化妆品、药品、食品和园林等方面，是著名的芳香植物和香料作物[2]。此外，茉莉花的根、茎、叶皆可入药，有重要的药用价值。我国是茉莉花主产区，栽培面积占世界三分之二，年产量占世界总产量一半以上[3]，因此茉莉花产业对于我国南方农村经济的快速发展有重要意义。

茉莉花自然败育率高、结实困难[4]，很难通过杂交获得新种质，目前生产上主要通过扦插繁殖。长期的无性繁殖使母株的优良性状退化，植株退化香气减弱现象经常出现[5]。利用基因工程技术对香型进行改造已在月季(Rosa hybrida)[6]、草莓(Fragaria × ananassa)[7]、矮牵牛(Petunia hybrida)[8]等多个物种中得以实现，为茉莉的香型改造提供了参考。但目前我国对于茉莉的研究仍以基础种植[3,9—11]、茉莉花茶窨制[12—15]、香气成分分析[16—17]等方面为主，在分子生物学方面的研究主要集中在香气合成相关基因克隆[18—20]、分子标记[21]等。多年来研究者一直在尝试建立其遗传转化体系，但进展缓慢。早期孙艳妮等[22]、何丽斯[23]、严华兵等[24]对双瓣茉莉的离体快繁体系进行了探索和优化，但未建立转化体系，后期甘煌灿等[25—26]探索了茉莉花愈伤组织遗传转化体系，主要以叶片和花瓣愈伤组织为对象，但对于转化体系的条件摸索并未多作报道。目前，茉莉的遗传转化再生体系仍在探索中。

本研究尝试以茉莉幼嫩的茎段为材料，利用农杆菌转化法将GFP基因向茉莉进行遗传转化，通过设置不同的预培养时间和筛选培养基抗生素浓度，统计抗性愈伤组织存活率、转化后生长状况以及检测茎段或愈伤中GFP荧光，探索能获得较高成活率的抗性愈伤组织以及适宜进行转化检测的预培养和筛选方法，为利用茉莉转化体系进行基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

双瓣茉莉种植于福建农林大学园艺学院的人工气候室内，气候室温度26 ℃，光照周期16 h/8 h(昼/夜)，相对湿度70%左右。剪取当年生嫩枝作为外植体进行转化。

1.1.2 主要试剂

链霉素(Streptomycin,Str)；WPM培养基粉末(生工)；头孢霉素(Cefotaxime sodium,Cef)；利福平(Rifampin,Rif)；6-BA(6-Benzylaminopurine)；NAA(1-Naphthalene acetic acid)；乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)；Tween-80；多菌灵；庆大霉素(Gentamicin,GM)；巴氏消毒液；卡那霉素(Kanamycin,Kan)；蔗糖(生工)；琼脂粉(生工)。

1.1.3 农杆菌菌株与载体

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株株系为GV3101，植物表达载体为GFP阳性对照质粒(pCAMBIA1300)骨架，细菌抗性Kan，植物抗性潮霉素Hyg，启动子为35S。载体适合烟草注射瞬时表达及拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等的稳定转化，由福建省农业科学院生物技术研究所陈松彪研究员惠赠。

1.1.4 培养基配方

1/2MS液体培养基：取2.22 g MS粉溶于1 L超纯水中，121 ℃灭菌20 min备用。LB液体培养基：10 g胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，溶解于1 L超纯水中，调节pH 7.0左右，121 ℃灭菌20 min备用。LB固体培养基为LB液体培养基添加15 g·L-1琼脂粉。WPM基本培养基：1 L超纯水中加入2.14 g WPM粉末和0.56 g硝酸钙，116 ℃灭菌30 min备用。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

将枝条去除叶片和顶端幼嫩部分，剪成约3 cm茎段装入500 mL锥形瓶。用洗衣粉水将茎段清洗干净，超纯水清洗5～8次。加50 mg·mL-1链霉素和0.5 g·L-1多菌灵于锥形瓶，200 r·min-1振荡80 min。转入干净的组培瓶，加入适量75%酒精，以刚好没过外植体材料为宜，轻柔晃动30 s，倒出酒精，无菌水清洗3～4次，倒入加有2～3滴Tween-80的20%巴氏消毒液(主要成分为NaClO) 100 mL，摇晃杀菌15 min，无菌水清洗多次，再将茉莉茎段切成长1 cm左右待接种。

1.2.2 预培养及其时间设置

在WPM基本培养基的基础上，添加20 g·L-1蔗糖、6.75 mg·L-1NAA和2.25 mg·L-16-BA，6 g·L-1琼脂，充分混匀，调节pH 5.8，高温煮沸三次使琼脂溶解，分装于组培瓶，然后116 ℃高压灭菌30 min。

每瓶接种5～7个茎段外植体，置于28 ℃左右、光照周期12 h/12 h(昼/夜)组培室内培养，预培养天数设4、7、10、15、20 d，每种预培养条件接种120个。预培养后进行农杆菌侵染，再转至添加80 mg·L-1抗生素的筛选培养基，记录筛选培养的抗性愈伤生长状态，期间及时清理污染的组培瓶。

1.2.3 农杆菌侵染液制备

将含GFP表达载体的农杆菌在含有GM、Rif、Kan三种抗生素的LB培养基上进行划线，28 ℃培养2 d获得单菌落，放置于4 ℃冰箱备用。侵染前两天制备农杆菌侵染液。挑取农杆菌单菌落，放入5.0 mL LB液体培养基(含50 mg·L-1GM、50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Kan)，于28 ℃、200 r·min-1条件下振荡培养过夜，再取适量菌液接种于50 mL LB液体培养基(菌液OD600初始值0.2左右)继续28 ℃、200 r·min-1振荡培养若干小时至OD600值为0.6～0.8。将菌液4000 r·min-1离心10 min收集菌体，加入重悬液(1/2 MS+100 mmol·L-1AS)，重悬菌体至OD600为0.6～0.8备用。

1.2.4 共培养

选取预培养的外植体放入灭菌组培瓶，并加入含GFP报告基因的农杆菌侵染液侵染20 min，期间不断轻柔晃动。取出外植体晾干，接种于共培养基(WPM+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂+2.25 mg·L-16-BA+6.75 mg·L-1NAA+15 mg·L-1AS)，每瓶5～6个茎段，于28 ℃左右暗培养2 d。

1.2.5 筛选培养及抗生素浓度设置

用含300 mg·L-1Cef无菌水溶液清洗共培养茉莉茎段，重复3～4次，每次10 min，再用无菌水反复冲洗若干次。将茉莉茎段晾干接种至含有卡那霉素的筛选培养基(WPM+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂+2.25 mg·L-16-BA+6.75 mg·L-1NAA+300 mg·L-1Cef)。其中，卡那霉素设置6个浓度，分别为40、60、80、100、120、140 mg·L-1。每浓度接种100个外植体，统计外植体的褐化数。

1.2.6 转化愈伤组织中GFP荧光检测

选择预培养7 d再筛选培养3 d和30 d生长良好的抗性茉莉愈伤组织，以及预培养20 d再筛选培养14 d的茉莉茎段和茎段组织，在Leica体视荧光显微镜下观察茉莉花抗性愈伤组织的GFP荧光。

2 结果与分析

2.1 预培养时间对茉莉茎段侵染后存活的影响

结果显示，茎段预培养4 d，经农杆菌侵染后外植体发生褐化和污染，成活率为55.8%；茎段预培养7 d时，茎段侵染后成活率显著提升至80.8%；当茎段预培养延长至10 d、15 d时，茎段侵染后成活率分别为76.7%、75.0%，显著高于预培养4 d的茎段，说明愈伤组织生长较多(表1)。预培养7 d的茎段抗性愈伤生成率最高。

表1 预培养时间对双瓣茉莉抗性愈伤存活的影响Table 1 Effect of pre-culture time on the survival of jasmine callus

2.2 抗生素浓度对茉莉外植体存活的影响

将预培养7 d的茎段进行GFP基因农杆菌遗传转化后接种至含不同浓度Kan的筛选培养基上。筛选培养30 d后，在含40 mg·L-1和60 mg·L-1Kan的培养基中茎段褐化率为0。随着培养基中Kan含量不断增加，愈伤组织褐化率不断上升，当Kan浓度为100 mg·L-1时，褐化率升至100%(表2)。确定适宜双瓣茉莉愈伤组织筛选的Kan质量浓度为80～100 mg·L-1。

表2 卡那霉素浓度对茉莉抗性愈伤组织褐化的影响Table 2 Effects of kanamycin concentration on browning of jasmine resistant callus

2.3 茉莉茎段遗传转化的GFP荧光检测

预培养7 d后侵染可提高抗性愈伤的存活率，但侵染后长势较慢(图1:A,B)。相比之下，预培养20 d后茎段长出部分愈伤组织，虽然抗性愈伤的存活率相对较低，但侵染时接触面更大，侵染后体积更大(图1:C～F)。将GFP基因转化预培养7 d的茉莉茎段，转化3 d后及30 d后均可检测到GFP荧光(图2:A,C)，而未转化的茎段中无GFP荧光(图2:A,B)。将GFP基因转化预培养20 d的茉莉茎段并筛选培养14 d后也可检测到GFP荧光(图2:D)，而未转化茎段培养30 d后未能检测到荧光(图2:B)，说明GFP基因转化茎段后，随着茎段的生长，愈伤组织中也转入了GFP基因。此外，直接转化预培养天数更长的茉莉茎段愈伤组织，也可使GFP基因直接转入愈伤组织中表达。

图1 预培养7 d和20 d后进行侵染并再培养30 d的茉莉茎段形态Fig.1 Morphology of jasmine stems pre-cultured for 7 d or 20 d and cultured for 30 d after transformed

图2 GFP基因转化茉莉茎段后荧光检测Fig.2 Fluorescence detection of GFP in transformed jasmine stem and callus

3 讨论

外植体在侵染前先预培养一定时间可以减轻农杆菌感染过程中的应激损伤，并促进细胞分裂，使其处于对农杆菌更加敏感的活化状态，易于农杆菌吸附，从而提高外植体的转化效率[27]。甘煌灿等[25]使用茉莉花愈伤组织转化外源基因，但对愈伤组织的来源和选用时间并未进行交代。本研究设置5个不同的外植体预培养时间，发现预培养7 d后进行侵染，获得抗性茎段组织的存活率最高，但转化后的茎段生长缓慢，远不如未转化的茎段。预培养20 d的茎段可长出较大的愈伤，此时再进行转化，接触面更大，虽然污染率也加大，但进行外源GFP检测时体积更大，更易观察。

甘煌灿等[25—26]在对茉莉花愈伤组织转化的探索中主要使用MS为基本培养基，并添加氨基酸和无机酸。本研究使用WPM为基本培养基，且未添加其他营养物质，发现共培养、筛选培养等阶段，茎段或愈伤组织在生长速度上未见显著差异。

甘煌灿等[25]使用茉莉花愈伤组织进行转化时，摸索了不同潮霉素浓度对茉莉愈伤组织生长的影响，发现愈伤组织对潮霉素较敏感，但未对其他常见的抗生素浓度进行筛选。本研究探索了不同浓度Kan对茉莉茎段筛选的作用，发现适宜双瓣茉莉愈伤组织筛选的Kan质量浓度为80～100 mg·L-1，对于以Kan作为抗性的双元载体转化有参考意义。

甘煌灿等[25,28]用于转化的茉莉花愈伤组织来自于茎段或花瓣。本研究主要使用茎段或带愈伤组织的茎段进行转化，发现茎段也可直接进行转化，虽然后期污染率低，成活率高，但转化后生长较慢；使用愈伤组织直接进行转化，荧光检测更易观察，对于检测GFP融合蛋白表达的研究可在获得较好的检测效果的前提下有效地缩短时间。本研究中，茉莉茎段进行GFP基因转化并筛选培养3 d和30 d，可在茎段和愈伤中检测到GFP荧光，表示GFP基因随着茎段的生长在愈伤中仍可表达，而不是一种瞬时表达。可为后续茉莉花基因功能研究提供参考。