芍药苷促进小鼠成骨分化抗骨质疏松作用的实验研究

杨立宇 郭然 牟帅 张一奇 杨礼庆 付勤

中国医科大学附属盛京医院骨科，辽宁 沈阳 110003

骨质疏松症(osteoporosis，OP)作为影响广大老龄患者尤其是绝经后人群的重要疾病之一，已经愈发得到现代医学的关注。骨质疏松症是以钙含量减低、骨微结构遭到破坏、骨骼强度、韧性衰减为特点，最终导致骨骼质量下降,发生脆性骨折的全身骨代谢疾病[1-2]。目前临床上抗骨质疏松治疗主要以抗骨吸收药物为代表，如双膦酸盐类、降钙素类，这类药物虽可显著减缓骨密度下降的程度，但是用药同时抑制骨形成活动，用药后脆性骨折再发率仍较高，存在下颌骨坏死等弊端[3]。而现有的一些促进骨形成药物亦存在着潜在的致癌风险[4]。相比之下，传统中医药则具备温和安全、双向调控等优点，愈发引起现代医学研究的关注。

芍药苷(paeoniflorin，Pa)作为传统中药白芍总苷的主要成分之一，在中医传统处方中起着抗炎、利尿的作用[5]。目前研究发现芍药苷除了以上功能作用之外，还具备抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等作用[6-7]。在骨质疏松治疗方面，有研究[8]表明芍药苷可以抑制NF-κB信号通路来降低破骨细胞的分化功能、缓解类风湿关节炎患者骨丢失的症状[9-10]。但是芍药苷对成骨分化的作用影响仍缺乏相关实验研究，本研究的目的是探讨芍药苷对成骨细胞成骨分化的干预作用，并观察其对骨质疏松小鼠模型的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：8周龄C57BL/6小鼠24只(北京华阜康生物科技公司，中国)。随机将小鼠分为三组，假手术组(Sham组)、骨质疏松模型组(OVX组)、芍药苷干预组(OVX+Pa组)。给予Sham组仅开腹后便缝合腹膜，而OVX与OVX+Pa组则行双侧卵巢摘除术。术后一周开始各组对应干预，OVX+Pa组每日进行芍药苷(50 mg/kg)腹腔注射，而Sham组与OVX组则给予等体积盐水注射，干预12周后取材。

1.1.2实验细胞：采用小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1(来源于中国科学院上海研究院细胞库)。

1.1.3实验药物：芍药苷(Sigma-Aldrich，美国)。

1.1.4实验试剂：α-MEM培养基、胰酶-EDTA、进口胎牛血清、PBS溶液(Biological Industries，以色列)；OPG、RANKL抗体(万类试剂，中国)；Runx2抗体(Abcam，美国)；β-actin抗体、碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒(碧云天，中国)；免疫组化二抗(中杉金桥，中国)；抗原修复液(博士德生物科技，中国)；DAB染色试剂盒(迈新生物，中国)；HE染色液、茜素红染色液(索莱宝，中国)。EDTA脱钙液、引物(上海生工，中国)；荧光定量PCR试剂盒(Takara，日本)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞培养：将MC3T3-E1细胞接种于α-MEM培养基中，其中含10 %的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的链霉素。孵箱培养条件设定为温度37 ℃、气体条件为5 % CO2，每48 h进行换液，添加不同浓度的芍药苷进行干预。

1.2.2CCK-8细胞增殖实验：将MC3T3-E1细胞在96孔板中以5 000 cell/mm2的密度铺板，每个实验组设置5个复孔，每孔中培养基的体积为100 μL。24 h后，加入不同浓度的芍药苷干预血清，48 h后，每个复孔加入90 μL含血清培养基之外，再加入10 μL CCK-8检测液，37 ℃孵箱内进行孵育2 h，酶标仪(美国Biotek)在450 nm处测量吸光度值。

1.2.3ALP活性、染色实验：将MC3T3-E1细胞铺设于6孔板中，分别向每孔中加入3 mL药物干预血清，对照组则加入相同浓度的成骨诱导剂(Vitamin C 50 μg/mL、Dexamethasone 100 mmol/L和β-sodium glycerophosphate 10 mmol/L的混合液)， 每48 h换液一次，连续培养一周。采用150 μL的Ripa裂解液裂解细胞，离心后收集上清液作为样品。96孔板中加入50 μL底物、30 μL缓冲液和20 μL样品，总体积共100 μL。充分混匀后,37 ℃温育15 min，酶标仪测吸光度值。ALP染色则吸除原有培养基，PBS轻柔清洗孔底细胞2～3遍，4 %多聚甲醛室温下固定10 min，洗涤后加入300 μL显色液。室温避光孵育2 h后，PBS轻柔洗涤，光学显微镜(Elipse Ci-L)(日本Nikon公司)观察并照相。

1.2.4茜素红染色实验：6孔板中，每孔加入不同浓度的芍药苷干预血清和相同浓度的成骨诱导剂，培养2周，每48 h换液一次。染色步骤同ALP染色，确认染色良好后，进行光镜下观察并照相。紧接着进行半定量检测，每孔加入1 mL 10 %十六烷基吡啶，轻微振荡洗脱染料后，吸取200 μL上清液加入96孔板中，每组3个复孔，采用酶标仪540 nm测吸光度值，与标准曲线对应出相对浓度。

1.2.5实时荧光定量PCR(RT-PCR)：提取总RNA后进行纯度以及浓度检测。确认无误后采用试剂盒进行反转录，合成cDNA。于95 ℃预变性15 min，同温度下变性20 s，于58 ℃退火30 s,在72 ℃下延伸30 s，如此反复扩增40个循环。采用荧光定量PCR仪(7500 fast，美国)进行检测，采用β-actin作为内参进行定量分析，每组设3个平行复孔，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real time PCR

1.2.6Western blot检测：取不同浓度芍药苷干预72 h的细胞，Ripa裂解液冰上裂解15 min，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白样品浓度，用蛋白上样缓冲液稀释每组蛋白样品至3 μg/μL，在电泳孔道中，每组加入10 μL，而后冰水浴中转膜至PVDF膜上，5 %的脱脂牛奶封闭，一抗溶液中4 ℃孵育过夜。次日室温条件下二抗溶液中孵育2 h。轻柔加入显影剂，采用化学发光成像系统(C300，美国Azure)使蛋白条带显影，应用Image J软件对蛋白条带进行密度分析。

1.2.7HE染色和免疫组织化学检测：应用石蜡切片机(Microm HM 340E，美国)对标本进行3 μm厚度切片。二甲苯脱蜡后，不同浓度乙醇褪去二甲苯。苏木素染色、自来水返蓝后伊红染色，蒸馏水洗去附着的染色液。显微镜下观察颜色结构良好后，脱水，二甲苯透明封片。光学显微镜下观察干骺端附近骨小梁厚度以及结构。免疫组织化学染色步骤：脱蜡后采用抗原修复液覆盖标本区域37 ℃孵育30 min，而后室温下阻断内源性过氧化物酶，一抗抗体4 ℃孵育过夜。室温下二抗孵育30 min，与链霉素过氧化物酶室温孵育20 min。滴加新鲜配制的DAB显色液，苏木素复染，自来水返蓝，脱水封片。应用Image-Pro Plus软件进行统计分析。

1.2.8micro-CT分析：颈椎脱位法后取小鼠左侧胫骨，4 %多聚甲醛固定72 h，采用micro-CT(Cheetah EVO，YXLON，德国)进行扫描，扫描厚度为6～7 μm，源电压80 kV，源电流35 μA，曝光时间选择为720 ms。采用系统自带的分析软件对获取图像进行定量分析，主要参数有骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁宽度(Tb.Th)、骨小梁间隔(Tb.Sp)以及骨小梁体积(BV)和扫描组织体积(TV)。

1.3 统计学处理

结果数据采用SPSS 17.0软件进行统计计算，全部计量数据以均数±标准差(SD)表示，各组间比较采用t检验方式，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度芍药苷对体外MC3T3-E1细胞活力的影响

与对照组相比，芍药苷对体外MC3T3-E1细胞活力无明显影响(P>0.05)，见图1。

图1 芍药苷对MC3T3-E1细胞活力的影响Fig.1 Effect of paeoniflorin on the viability of MC3T3-E1 cells

2.2 芍药苷促进体外MC3T3-E1细胞的成骨分化

中、高剂量芍药苷能够明显提升MC3T3-E1细胞ALP的表达，且高剂量干预组(20 μmol/L)效果显著(P<0.01)。成骨分化诱导剂干预14 d后，高剂量组钙结节的数量与密度明显高于对照组，结果显示给予芍药苷干预能够明显促进MC3T3-E1细胞的矿化能力(P<0.01)。见图2。

图2 芍药苷对MC3T3-E1成骨分化能力的影响(光镜下100倍放大)注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.2 Effect of paeoniflorin on osteogenic differentiation of MC3T3-E1(Scale bar: 100× magnification)

2.3 芍药苷对体外MC3T3-E1细胞的成骨分化基因的影响

中、高剂量芍药苷干预组显著提升了成骨分化基因OPG、Runx2以及Colα1的mRNA表达(P<0.05)，降低了破骨分化相关基因RANKL的mRNA表达(P<0.05)，差异有统计学意义，见图3。

图3 芍药苷对MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因的影响注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.3 Effects of paeoniflorin on genes related to osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

2.4 不同浓度芍药苷干预后相关蛋白表达情况

高剂量芍药苷干预组能够显著提升MC3T3-E1成骨分化蛋白OPG、Runx2蛋白的表达(P<0.01),降低破骨分化蛋白RANKL蛋白的分泌(P<0.01)，见图4。这一结果与RT-PCR结果相符合。

图4 芍药苷干预后成骨分化相关蛋白表达情况注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.4 Expression of osteogenic differentiation related proteins after paeoniflorin intervention

2.5 HE染色和免疫组织化学分析结果

与Sham组相比，OVX组骨小梁间隔明显增大，骨小梁变得细短而且排列稀疏；OVX+Pa组较OVX组骨小梁数量以及厚度有所增加。免疫组织化学结果显示，Sham组中Runx2蛋白主要分布于骨小梁的表面成骨细胞内以及干骺端附近的骨细胞陷窝中，而OVX组表达较少，OVX+Pa组有所恢复。半定量分析显示，OVX组与OVX+Pa组较Sham组Runx2蛋白表达均显著下降(P<0.01)，但芍药苷组下降程度更少，与OVX组比较芍药苷明显提升骨质疏松小鼠体内的Runx2蛋白表达(P<0.01)。见图5。

图5 小鼠股骨远端干骺端附近骨小梁HE染色以及Runx2蛋白免疫组织化学染色情况(光镜下200倍放大)注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，##P<0.01。Fig.5 HE staining of trabecular bone near metaphyseal of distal femur and immunohistochemical staining of Runx2 protein(Scale bar: 200× magnification)

2.6 芍药苷对小鼠骨微结构的影响

与Sham组相比，OVX组在BV/TV(骨小梁体积比)、Tb.N(骨小梁数量)、Tb.Th(骨小梁厚度)都显著下降(P<0.01),而Tb.Sp(骨小梁间隔)显著加宽(P<0.01)。而OVX+Pa组，Tb.Sp、Tb.Th未见明显差异(P>0.05),BV/TV以及Tb.N较Sham组下降明显(P<0.01)；同时OVX+Pa组与OVX组相比较，显著提升了BV/TV(骨小梁体积比)、Tb.N(骨小梁数量)和Tb.Th(骨小梁厚度)，有效降低了Tb.Sp(骨小梁间隔)(P<0.01)。见图6。

图6 Sham组、OVX组和OVX+Pa组胫骨近端干骺端micro-CT分析 A：各组典型的micro-CT影像；B：各组Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th、BV/TV的统计学分析结果。注：与Sham组比较，**P<0.01；与OVX组比较，##P<0.01。各组n=8。Fig.6 Micro-CT analysis of proximal tibial metaphyseal in the Sham group, OVX group and OVX+Pa group A：Typical micro-CT images of each group; B：Statistical analysis results of Tb.N, Tb.Sp, Tb.Th and BV/TV in each group.

3 讨论

骨形成与骨吸收活动失衡，是骨质疏松症发生发展的重要原因。成骨细胞构造骨组织形成活动，而破骨细胞拆解钙离子以及胶原组织形成骨吸收活动[11]。成骨分化活动主要是由成骨细胞前体细胞的增殖与分化来调节[12]，而Runx2和Osterix这两种转化因子起到重要促进的作用，表现为骨基质蛋白的分泌增加，碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原纤维表达量(Colα1)升高(如图3)，这些微观的改变进一步促进骨组织钙盐的沉积以及骨小梁的形成[13]。成骨分化通常分为两个阶段，在早期阶段碱性磷酸酶作为关键标志物起到作用，可以促进相关成骨分化基因Colα1、OPN(骨桥蛋白)的表达；而在成骨分化的晚期阶段特点是骨细胞外基质的形成，表现为钙盐沉积在骨小梁网状结构中[14-15]。本研究表明芍药苷可以有效地促进碱性磷酸酶以及成骨分化因子的分泌，进一步增强成骨细胞的矿化活动(见图2～图4)，说明芍药苷在成骨分化的早期以及晚期均起到了促进作用。

破骨细胞分化的进程受到了成骨细胞所分泌的两种重要因子-骨保护素(OPG)以及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的影响。核因子κB受体活化因子配体(RANKL)通过与核因子κB受体活化因子(RANK)受体结合激活并调节破骨细胞分化的进程[16]。而成骨细胞分泌的OPG可以阻止RANKL与RANK的结合，从而达到抑制破骨细胞增殖分化的作用。故OPG与RANKL表达比在观察骨吸收与骨形成活动时是一个重要的指标[17]，通常在骨质疏松症发生发展时，即骨吸收增强、骨形成减弱时，这一比例大大降低；而治疗的目的是增强骨形成，降低骨吸收，提高OPG与RANKL这一比值。通过本研究发现，芍药苷可以提高MC3T3-E1细胞OPG的mRNA与蛋白的表达，并减少RANKL的表达(见图3、图4)，改善并提高了OPG/RANKL的比值关系，在促进成骨分化的基础上一定程度地抑制了破骨细胞的分化。

为了进一步验证芍药苷的抗骨质疏松作用，本次研究进行了骨质疏松模型小鼠体内验证。卵巢摘除模型小鼠是作为模拟原发性骨质疏松最为可靠的模型之一[18]，能够最大程度的反映绝经后女性有关的临床与生理变化，有研究[19]表明，当卵巢摘除后低雌激素水平改变了骨细胞外的微环境，打破了既有的骨吸收/骨形成平衡，增加了骨转换的程度，即增加破骨分化以及成骨细胞凋亡。笔者通过骨组织切片和组织免疫化学发现，芍药苷可以改善骨小梁的厚度，增加干骺端附近Runx2蛋白的表达(见图5)，说明芍药苷不但在体外实验中可以促进成骨细胞的分化，同样在体内实验中得到了确认。为了进一步定量、微观分析，笔者进行了micro-CT检测。结果显示，芍药苷增加了检测区域内的骨小梁数量，厚度，并降低骨小梁之间的间隙(见图6)。

既有的研究已表明芍药苷可以通过抑制骨吸收活动达到抗骨质疏松的作用[8]，本研究则通过体内与体外实验进一步说明芍药苷具有双向调节作用，在抑制骨吸收的同时，直接作用于成骨细胞增加骨形成活动，进一步证明了芍药苷的抗骨质疏松作用。而最新的相关文章[11]表明，NF-κB信号通路起到了关键作用，芍药苷可通过抑制NF-κB信号通路减少破骨细胞的分化，而当使用TNF-α干预成骨细胞上调NF-κB信号通路时，成骨分化活动受到明显抑制，给予芍药苷可以缓解NF-κB信号通路的抑制作用。说明NF-κB信号通路可能是芍药苷的重要作用信号通路，其抗骨质疏松的具体作用靶点以及分子机制，需要进一步的深入研究。