HPV 分子生物学检测方法研究进展

彭小媚，陈栋，林永恩，陈善昌

(广西贺州市人民医院检验科，广西 贺州）

1 前言

宫颈癌仍然是全世界女性中第三大最常见的癌症，每年约有529，800 例新病例和275，100 例死亡[1,2]。值得注意的是，宫颈癌的发病率在发达国家和欠发达国家之间是不成比例分布的[3]。在发达国家，因为有癌症筛查和政府巨额预算资助的HPV 疫苗接种[4]，宫颈癌的发病率和死亡率已逐渐下降[5]，而在欠发达国家中[6,7]，宫颈癌是仍然是女性中最普遍的癌症之一，也是癌症死亡的主要原因。例如，在中国，观察到宫颈癌的发病率和死亡率趋势显著增加，尤其是在年轻女性中[7]。宫颈癌已成为15 至44岁的中国女性中第二常见的女性癌症和第三大癌症死亡原因[8]。在印度，子宫颈癌是女性癌症的第二大诱因。估计每年全世界子宫颈癌死亡人数的四分之一（约77，100 万）发生在世界第二人口稠密的国家[8,9]。

人类乳头瘤病毒（HPV）感染是全世界最常见的性传播感染，持续性宫颈感染是宫颈癌的高风险因素。此外，宫颈粘膜上皮细胞中HPV 感染的持续存在，癌前病变（宫颈上皮内瘤变3 即CIN3）与宫颈癌之间存在明确的病因学联系。如今，已经定义了200 多种HPV 基因型，其中50 种可以感染宫颈上皮细胞。但是，只 有16 种HPV 类 型（16、18、31、33、34、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、70）被归类为高风险（hrHPV），而14 种（排除34 和59）显示出与宫颈癌有因果关系的强有力证据。基于hrHPV 与宫颈癌之间明确的因果关系，美国阴道镜和宫颈病理学学会指南建议在筛查人群中进行HPV DNA 检测而不是细胞学检查。与基于细胞学的筛选方法相比，HPV 分子生物学检测不依赖于形态学解释，而是基于HPV DNA，HPV mRNA 或其他病毒标记的检测。在过去的二十年中，HPV 检测已成为许多国家宫颈癌筛查，分类和治疗后随访临床指南的重要组成部分，本文就国内外普遍应用的HPV 分子生物学检测方法及其应用进展作一简述。

2 目前用于宫颈筛查的HPV 检测方法

2.1 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术

聚合酶链反应技术简称PCR 技术，是一种利用DNA 变性和复性原理在体外进行特定的DNA 片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100 万-200 万份拷贝。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。一般认为，PCR 技术有高敏感度、高特异性的特点，简便快速，临床应用广泛[10]。

2.2 反向斑点杂交技术

这种技术是把寡核苷酸探针固定在固相尼龙 膜上，标本进行HPV DNA 提取，PCR 扩增后杂交，显色及结果判读。PCR 反向斑点印迹HPV 基因分型作为在医院为基础的人群中子宫颈癌的主要筛查测试，是一种成本较低且有效的宫颈癌初筛，用于基于医院的机会性筛查。目前用于23 种类型的PCR 反向斑点印迹 HPV基因分型试剂盒（深圳亚能有限公司）可以检测出18 种HR-HPV类型，包括HPV-16，-18，-31，-33，-35，-39，-45， -51，-52，-53，-56，-58，-59，-66，-68，-73，-82 和-83，以及5 种LR-HPV类型，包括HPV-6，-11，-42，-43 和-81。此方法已获得中国食品药品监督管理局的许可。所有检测程序均按照试剂盒提供的制造商说明进行[11]，其特异度、敏感度分别为95.36%和96.36%，PCR 反向斑点印迹HPV 基因分型测试可以为HPV 检测提供可靠且敏感的临床参考[12]。长期的观察研究表明，HPV-16 和HPV-18 与高度宫颈病变的风险升高相关[13]。与基于PCR 的方法相比，PCR 反向斑点印迹HPV 基因分型测试作为一种主要筛查方法，在检测CIN2+/CIN3+方面具有更高的灵敏度和特异性，且误诊率最低。

2.3 第2 代杂交捕获法(HC2)

Hybrid Capture 2（HC2）HPV DNA 测试已被广泛用于确定HPV 感染以及检测HSIL 和宫颈癌。通常，CIN2 检测的灵敏度为84.9%至100%，特异性为69.5%至95.8%[14]。HC2 技术利用特异性识别HPV DNA 序列的RNA 探针对待测样本进行捕获，然后通过标记的抗体识别杂交链，放大杂交链光信号，通过测定光信号对13 种高危型HPV 进行半定量检测[15]。1999 年，HC2 测试被美国食品和药物管理局（FDA）批准为检测13 种hrHPV 基因型的金标准。但是，该测试具有一些缺点，包括无法将HPV16 或HPV18与其他hrHPV 区别开来，并且没有内部控制。此外，HC2 测试与探针混合物与非靶向HPV 类型的有一定的交叉反应。

2.4 实时荧光定量 PCR

这项新技术是在80 年代中期对聚合酶链反应（PCR）的改进。通过PCR，基本上可以以循环过程扩增复杂样品中存在的任何核酸序列，以产生大量易于分析的相同拷贝。但是，作为一种分析技术，原始的PCR 方法存在一些严重的局限性。通过首先扩增DNA序列，然后分析产物，定量非常困难，因为PCR 产生了基本上相同量的产物，而与最初存在的DNA 模板分子的量无关。这种限制在1992 年由Higuchi 等人开发了实时荧光定量PCR 解决了。在实时PCR 中，通过监测与反应产物成正比的染料或探针的荧光，以及与获得产物所需的扩增循环数成正比，来监测反应过程中形成的产物量。特定数量的DNA 分子被记录下来。假设一定的扩增效率，通常接近每个扩增循环的分子数量的两倍，则可以计算最初存在于样品中的扩增序列的DNA 分子的数量。借助当今可用的高效检测化学方法，灵敏仪器和优化测定方法，可以以前所未有的准确度和灵敏度检测复杂样品中特定序列的DNA 分子的数量，足以检测单个分子。这类方法不但能检出具体的HPV 亚型，而且可以对病毒负载量进行检测，有些目前已被FDA 批准用于临床应用。这类方法检测敏感，成本低，用时也比较短，仅需约2.5h[16]。例如Cobas 4800 HPV 就是采用实时定量荧光技术。Cobas 4800 HPV Test[17]是2011 年被美国FDA 唯一批准可同时检测12 种高危HPV 及16 和18 型HPV 的试剂盒。该方法使用的是光谱独特的荧光染料标记TaqMan 探针，将25 微升样品添加到96 孔PCR板的25 mL 预混液中，之后转移至cobas 4800 系统的实时扩增和检测模块进行检测。临床研究表明，Cobas 试验的敏感性与与HC2 检测有很高的一致性（91.4%～98.0%）[18]，但是Cobas 试验具有更高的特异性，它与其他低风险HPV 型的交叉反应水平较低。Lapierre 等[19]研究发现，Cobas 4800 HPV 检测的重复性和特异性较好，已被越来越多的临床机构认可和购买使用。

2.5 下一代测序技术(next - generation sequencing， NGS)

目前，HPV 检测方法主要使用反向斑点杂交技术，信号扩增测定法（HC2），实时荧光定量PCR 的方法（COBAS 4800 实时测试）等。这些检测方法有一定的局限性，而下一代测序（NGS）技术克服了这些方法的局限性，NGS 不仅可以检测负荷量、病毒亚型，还可以检测细胞染色体DNA 水平的损害，例如HPV DNA 的插入位点及整合等，有各种各样的基因整合发现工具可以检测人类基因组中不同的病原体插入。这些工具有其特定的第三方需求，他们可以检测HPV 序列以及其他病毒的存在，缺点是检测设备复杂，检测试剂成本比较昂贵，对操作人员的整体知识水平要求也比较高[20,21]。更重要的是，它们本身并不是特定于HPV 检测的。近年来，由Helicos Biosciences 公司开发的NGS，和其他平台相比，已经大大降低了费用，并且检测效率有了很大的提高，目前已经得到了很多临床机构的认可[22-24]。

3 小结

目前已证实，宫颈 癌的主要致病原因是高危型 的HPV 感染，而持续性的高危感染更易引发宫颈癌，对于持续的HPV 感染，发展为子宫颈癌需要数十年的时间。因此，这个较长的时间窗口为临床干预提供了千载难逢的机会。对其感染进行 早期和正确的诊断，无疑对于宫颈癌及其他 HPV 相 关恶性肿瘤的预防及诊治有重要的临床意义和社会 价值[25]。目前市场上的绝大多数HPV检测都具有很高的分析灵敏度，它们可能会产生大量临床上无关紧要的阳性结果，截至2018 年7 月，只有14 种商业HPV 检测（在全球市场上HPV 检测中）可被认为已完全或部分通过了基于HPV 的子宫颈癌初步筛查[26]。临床对 HPV 检测方法要求灵敏度高，特异性好，结果准确、无交叉污染、检测时间短而快速、成本低、操作简单、且易于自动化。现有 HPV 检测方法尚不能满足以上所有要求。但随着分子生物学 检测技术的飞速发展，相信不久的将来就会有满足以上所有需求的HPV 检测方法出现，更好的服务于临床及实验室机构。