生物标记物在肺癌中的现状及展望

韩一鸣，邹晓倩，刘传勇

(1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安；2.山东大学附属济南市中心医院肿瘤科，山东 济南)

0 引言

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1,2]，其主要被分为两种类型，即小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSClC)(分别占15%-25%和75%-85%)。NSCLC 又被细分为腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌[3]。随着分子医学水平的不断提高，与肺癌发生发展相关的驱动基因逐渐被人类发现，肺癌患者最佳治疗手段的选择与其组织学类型和生物标记物状态密切相关[4]。

手术一直在早期NSCLC 治疗中占主导地位。对于那些被诊断为局部晚期的NSCLC 肺癌，常采取放射治疗联合化疗的综合治疗模式。对于诊断为晚期或转移性非小细胞肺癌的患者，治疗是否采取特异性药物取决于肿瘤的生物标记物，包括表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)，间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)，ROS1(ROS gene)，或 细 胞程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)[5,6]。因此，对于EGFR 激活突变或ALK/ROS1 易位患者可以采取分子靶向治疗，而PD-L1 阳性患者可以采用免疫疗法。

对于以上生物标记物阴性的晚期NSCLC 患者，标准的一线治疗是以铂类为基础的双联化疗(顺铂或卡铂联合另一种细胞毒类药物)[5,6]，加或不加抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗体(如，贝伐珠单抗)。然而，对于鳞状细胞型NSCLC 患者，不使用贝伐珠单抗。与非小细胞肺癌相比，基于生物标记物的分子靶向疗法目前不适用于小细胞肺癌患者[7]，其常采取放疗联合化疗的综合治疗模式[8]。

1 基于组织的生物标记物

1.1 EGFR 突变

EGFR 是HER/ErbB 受体酪氨酸激酶家族中的一员，该家族还包括HER2、HER3 和HER4[9,10]。

EGFR 基因在大约10%的高加索患者和高达40%-50%的亚洲非小细胞肺癌患者中发生突变[11]，尤其在不吸烟的东亚裔女性腺癌患者中。相比之下，单纯鳞状组织学患者中很少检测到EGFR 突变，但在混合腺鳞状组织学患者和大细胞癌患者中也可能存在突变。

虽然已经在EGFR 基因中检测到200 多种不同的突变，但最常见的两种类型是19 号外显子(exon 19del)的删失突变和21 号外显子(L858R)的点突变[12]。因为它们上调了EGFR 信号，并提高了对EGFR 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的敏感性，所以这些突变又称活化或增敏突变。较少见的EGFR增敏突变包括18 号外显子的G719A 和G719C 突变以及21 号外显子的L861Q 突变。另外20 号外显子的T790M 突变与EGFR TKIs 的获得性耐药有关[13]。

现在有几种不同的TKIs 用于治疗EGFR 突变的非小细胞肺癌患者，代表药物包括吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、阿法替尼(Afatinib)和奥西替尼(Oxitinib)[4-6，14]。

多个III 期临床试验的结果表明，与化疗相比，EGFR 突变的晚期NSCLC 患者使用EGFR TKIs 后的无进展生存率、应答率和生活质量都得到明显提高[15,16]。总体而言，60%-90% EGFR 突变的患者对EGFR TKIs 有治疗反应，中位无进展生存期较化疗延长约5 个月[15]。尽管如此，研究发现19 号外显子缺失突变的患者较21 号外显子L858R 突变的患者获益更大[16]。

因为EGFR 的突变与EGFR TKIs 治疗反应之间的研究结果具有一致性，专家小组建议在对晚期NSCLC 患者使用TKIs 药物前检测EGFR 突变状态[17-19]。然而在单纯鳞癌中很少发生EGFR 突变，故不推荐对于该种组织学类型的肺癌患者进行常规的EGFR 突变检测[20]。然而，美国国家综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南建议在从不吸烟、采用小组织活检而不是手术切除后诊断的患者或者组织学类型混合的鳞状细胞亚型患者中，可以检测其EGFR 突变状态[21]。

有两种主要方法可用于确定EGFR 的突变状态：下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)和多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)[22]。PCR 检测相比NGS 具有快速、高灵敏度的特点，然而，他们只能检测已知的突变。相比之下，NGS 可以检测到大量的基因改变，但不如PCR 灵敏，此外，测序还需要先进的生物信息学分析。除了各种研究检测外，美国食品药品管理署(Food and Drug Administration，FDA)已批准两个基于PCR 的商业试剂盒用于EGFR 检测。

研究发现[23]，很难从部分进展中的肺癌患者身上获取组织，但可以有效地从所有这样的患者身上获取血液样本。因此，Luo 等人[24]在比较血液和肿瘤组织中EGFR 突变的荟萃分析中发现血浆测量的总体灵敏度为67%，特异性为94%。另有研究报道，血浆检测的特异性接近100%[25]。事实上，血浆中EGFR 突变的检测与基于组织的检测对EGFR TKIs 的预测能力相似。因此，基于现有的证据，当无法获取肿瘤组织时，通过血液EGFR 突变检测的阳性结果可用于预测对EGFR TKIs 的反应[19]。

在2015 年，欧盟批准检测非小细胞肺癌患者血液中EGFR 突变情况，以供EGFR TKIs 治疗的决策之用。出于同样的目的，美国FDA 于2016 年批准Cobas EGFR test 用于检测血浆中EGFR突变状态。

EGFR 增敏突变、第一代EGFR TKIs 耐药突变以及T790M 突变均可在血浆中检测到[26]。大多数研究报道，血浆与肿瘤组织中检测到的EGFR T790M 状态之间的符合率在60%-98%之间[26-28]。此外，与EGFR 敏感突变一样，血浆T790M 突变对Oxitinib 的预测价值与组织结果相似。然而，如果血浆结果为阴性，仍建议对肿瘤组织进行检测[19]。

因此，对于对一代/二代TKIs 产生耐药性的患者，一种新兴的做法是检测血浆中的T790M 突变，如果阳性，则服用Oxitinib。反之，如果在血浆中没有发现T790M 突变，如果可行，应该继续进行T790M 突变的活组织检查。

1.2 ALK 重排

ALK 基因编码的跨膜酪氨酸激酶属于胰岛素受体超家族，该基因在2%-7%的NSCLC 中发生重排或易位[29]。ALK 重排常发生在那些从不吸烟/少量吸烟的年轻或组织学类型为腺癌的患者[30]。重排的基因编码一种具有组成性酪氨酸激酶活性的融合蛋白，该融合蛋白通过介导RAS-RAF、JAK/STAT 和PI3K 通路导致细胞过度增值[31]。利用这一信号传导机制，通过使用ALK 抑制剂阻遏这些传导通路以引发细胞死亡和肿瘤消退达到抗肿瘤的目的[32]。

美国FDA 已经批准四种ALK 抑制剂用于治疗表达ALK 基因重排的晚期NSCLC 患者，代表药物包括克唑替尼(Crizotinib)、阿来替尼(Alectinib)、色瑞替尼(Ceritinib)和布加替尼(Brigatinib)。其中克唑替尼是ALK 抑制剂中研究最广泛的药物。包括至少两个III 期临床试验在内的多项临床试验表明，应用克唑替尼治疗后的ALK 基因重排阳性的晚期NSCLC 患者获益优于化疗[33]。总体而言，57%-74%的表达ALK 基因重排的晚期非小细胞肺癌患者对克唑替尼存在治疗反应[32,33]。然而，最终大多数接受克唑替尼治疗的患者对药物产生耐药性。随后，美国FDA 批准Ceritinib、Alectinib 和Brigatinib 用于在使用克唑替尼后进展或对克唑替尼不耐受的ALK 阳性转移性NSCLC 的进一步治疗[34-37]。

检测ALK 基因重排与否主要有两种方法，即荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)和免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)[38]。一 直 以 来，FISH 被 认 为 是评估ALK 状态的金标准。然而，IHC 在病理实验室中更容易获得，相对容易操作，可以快速提供结果，并且相对经济[39]。IHC 在ALK 的特异性敏感检测上与FISH 检测达到了较高的一致性。事实上，在大多数研究中，IHC 和FISH 试验阳性之间的符合率已超过90%。因此，可以使用IHC 或FISH 常规评估ALK 基因重排状态[18,19]。

1.3 ROS1 重排预测克唑替尼疗效的研究

与ALK 相似，ROS1 具有酪氨酸激酶活性，同样是胰岛素受体超家族的成员[40]。该基因在1%-2%的非小细胞肺癌中发生重排，常见于不吸烟的年轻女性腺癌患者[41,42]。ROS1 基因重排似乎与EGFR 突变和ALK 重排互斥。由于这种明显的互斥性，有时仅在EGFR 突变和ALK 基因重排阴性的情况下才进行ROS1 检测。然而，为了提高效率和时间，Bubendorf 等人建议同时进行ROS1、EGFR 及ALK 的检测[43]。在具有ROS1 基因重排的转移性非小细胞肺癌患者中，克唑替尼的诱导反应率约为70%-80%[42,44]。因此，与ALK 基因重排一样，克唑替尼可用于治疗携带ROS1 基因重排的晚期非小细胞肺癌患者。

由于这种重排罕见发生，可采用IHC 作为筛查试验。若结果阳性，应通过有效的FISH 检测来进一步确认[18，19，45]。

1.4 PD-L1

PD-L1 是一分子量40 kDa 的1 型跨膜蛋白，它在体内多种不同类型的细胞中呈低水平表达[46]，参与免疫抑制调节。然而，在接触干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等细胞因子后，肿瘤细胞和免疫细胞中的PD-L1 水平会明显升高。据报道，通过应用特异性抗体和人为选择的Cut-off point 作参照，20%-95%的非小细胞肺癌细胞表达PD-L1，在20%-30%的非小细胞肺癌患者中高水平表达PD-L1(即≥50 个肿瘤细胞染色)[47-49]。

在癌症发生中，PD-L1 与程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)的结合避免了恶性细胞被免疫系统识别并清除。因此，用单克隆抗体阻断PD-L1 或PD-1 会消除这种保护作用，使免疫系统重新激活并以恶性细胞为靶点发挥生物学效应。三种阻断PD-1 和PD-L1 相互作用的单克隆抗体已被批准用于晚期NSCLC 的治疗[50]。其中帕博利珠单抗(Pembrolizumab)和纳武单抗(Nivolumab)靶向结合PD-1 位点，而阿特珠单抗(Atezolizumab)与PD-L1 靶向结合。在非小细胞肺癌中，Pembrolizumab 是这些抗体中研究最广泛的。

多项试验表明，PD-L1 高水平表达的晚期非小细胞肺癌患者比低水平表达的患者更有可能对Pembrolizumab 治疗有反应[51]。因此，在晚期NSCLC 患者的I 期临床试验中发现肿瘤细胞染色≥50%的患者比那些肿瘤细胞染色＜50%的患者有更高的应答率、更长的无进展生存期和总生存期[49]。一项III 期试验比较了Pembrolizumab 和多西紫杉醇在PD-L1 阳性的、既往接受过抗肿瘤治疗的晚期非小细胞肺癌(≥1%的肿瘤细胞阳性)患者中的疗效，结果显示采用Pembrolizumab 组的中位生存期较多西紫杉醇组延长1.9 个月[48]。同样，在PD-L1 水平升高的患者中(≥50%的肿瘤细胞阳性)，Pembrolizumab 治疗组的中位生存期较多西紫杉醇治疗组延长6.7 个月。既往未经治疗的PD-L1 水平升高(≥50%的肿瘤细胞阳性)的晚期非小细胞肺癌患者，使用Pembrolizumab 治疗的无进展生存期和总生存期明显长于以铂类为基础的化疗[52]。基于这些发现，美国FDA 批准Pembrolizumab用于高水平表达PD-L1(≥50%的肿瘤细胞染色)、无EGFR 突变或ALK 重排及先前没有接受过系统化疗的转移性NSCLC 患者的一线治疗。

目前已开发出用于IHC 检测PD-L1 的各种抗体，FDA 批准的PD-L1 辅助诊断指导了Pembrolizumab 在NSCLC 患者中的应用，其阳性和阴性检测的结果取决于使用的特定抗体和平台，用于检测PD-L1 的许多不同方法已引起病理学家和肿瘤学家的困扰[53,54]。

2 血清生物标志物

与以组织为基础的标记物不同，血清蛋白生物标记物在肺癌患者中没有得到广泛使用。确实，大部分已发表的与肺部恶性肿瘤患者诊断和治疗相关的指南未推荐任何血清生物标记物的应用。尽管如此，一些欧洲和亚洲国家还是进行了相关的血清生物标记物检测。虽然需要更多的临床证据加以验证，但特定的血清生物标记物在肺癌的鉴别诊断中可能是有用的，特别是在联合使用和无法进行组织诊断的情况下[55,56]。此外，一些血清生物标志物已被证明可以为肺癌患者提供独立的预后信息。然而，还没有一种方法被证实可以用来确定I 期肺癌患者的预后，大多标志物不能用于识别可能受益于辅助化疗的I 期非小细胞肺癌患者。特异性血清生物标记物的测定已被证明与晚期肺癌患者中系统治疗的反应相关。

在已提出的多种肺癌血清标志物中，研究最详细的有细胞角 蛋 白19 片 段(cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1)、鳞 癌 抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCCA)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)和神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)[55,56]。然 而，虽 然NSE 多 由SCLC 产 生，CYFRA 21-1 和SCCA 多由鳞状细胞癌产生，但没有一种标志物是肺癌特异的。

2.1 神经元特异性烯醇化酶

烯醇化酶是一种磷酸丙酮酸水合酶，它由三种不同单体(α、β和γ)的同或异二聚体组成。NSE 常在神经组织及从神经内分泌肿瘤(如小细胞肺癌和神经母细胞瘤)中表达，所以被称为烯醇化酶同工酶。

NSE 的检测可能有助于区分小细胞肺癌和非小细胞肺癌，特别是当无法通过组织诊断的时候[57]。通过对来自9 个独立中心的数据进行多变量分析(n=787)，结果显示NSE 是预测小细胞肺癌患者预后最有效的因素，优于肿瘤分期、患者体力状况(performance status，PS)、年龄、性别、CEA、LDH 和碱性磷酸酶[58]。除了可以预测预后外，NSE 水平已经被证明反映了小细胞肺癌患者对化疗的反应性[59]。因此，测定NSE 可能为监测小细胞肺癌患者的化疗反应提供一种相对廉价和微创的方法。一些研究结果也支持NSE可作为非小细胞肺癌患者预后的有用标记物[60-65]。

2.2 癌胚抗原

CEA 最常用于监测结直肠腺癌，但其浓度升高也可发生在其他几种恶性肿瘤中，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌亚型。CEA还可以提供NSCLC 的预后信息，并可能在监测晚期治疗反应方面发挥作用[59,66]。系统回顾和荟萃分析得出结论：CEA 预测化疗反应的敏感性为74.7%，特异性为69.8%[67]。

2.3 CYFRA 21-1

CYFRA 21-1 是目前可用于非小细胞肺癌，特别是鳞状细胞肿瘤的最敏感的血清生物标记物[68]。通过对来自9 个中心的综合数据分析，CYFRA21-1 是早期和晚期NSCLC 的独立预后因子[69]。此外，CYFRA 21-1 有可能用于监测晚期非小细胞肺癌的治疗情况。荟萃分析得出结论：对于区分完全/部分缓解和稳定/进展性疾病，CYFRA 21-1 的敏感性为79.1%，特异性为60.6%[67]。此外，初步数据显示CYFRA 21-1 在接受EGFR TKIs 抑制剂治疗的患者中可能具有预后价值[70,71]。然而，由于Crizotinib 可提高其血清水平，故CYFRA 21-1 不应用于监测对该化合物的反应。

2.4 鳞状细胞癌抗原

SCCA 是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员[71]。虽然SCCA 对NSCLC 的敏感性低于CYFRA 21-1，但SCCA 对鳞状细胞癌有更高的特异性。结合该两种血清标志物，更有助于肺癌的鉴别诊断[56,72]。

3 结论

在过去的十年中，肺癌生物标记物的研究取得了重大进展。对于非小细胞肺癌基于组织的预测性生物标记物尤其如此。因此，除了EGFR、ALK 和ROS1 之外，几个其他潜在的突变也可以发挥重大作用，这些突变包括MET(MET gene)突变/扩增、BRAF(BRAF gene)突变、RET(RET gene)融合、PIK3CA(PIK3CA gene)突变和HER2 突变/扩增。EGFR、ALK 和ROS1 检测应作为广泛的分子图谱方法的一部分，目的是识别可能已经有有效药物治疗的罕见驱动因素的突变[18,19]。与组织生物标记物相比，血清蛋白生物标记物在肺癌中的临床应用较少。未来的工作应该旨在将这些生物标记物纳入正在进行的随机试验中，研究小细胞肺癌和非小细胞肺癌的新疗法。这些传统的蛋白质生物标记物应该与基于循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)的生物标记物进行比较，以确定它们在预后和监测治疗方面的有效性。