网购流通过程中大眼金枪鱼鲜度指标和生物胺的变化研究

李少丽，李来好，杨贤庆，邓建朝*，陈胜军，李春生，胡晓，戚勃

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室， 广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306)

大眼金枪鱼(Thunnusobesus) 又名肥壮金枪鱼，属鲈形目鲭科，大洋性洄游鱼类，分布于印度洋、大西洋和太平洋等海域[1-3]。金枪鱼肉质鲜美、营养丰富，不仅富含蛋白质，还含有大量的DHA和EPA等不饱和脂肪酸[4]，食用和商用价值极高。据最新国际渔业动态报道[5],金枪鱼类市场不仅鱼价指数近年来持续增长，捕捞水平也在持续升高。

金枪鱼的蛋白质和游离氨基酸含量极高[4]，因此金枪鱼在存放过程中极易出现腐败变质的现象。目前对金枪鱼新鲜度的判断，主要集中在pH值、TVB-N、菌落总数以及K值等鲜度指标。但在金枪鱼腐败过程中，生物胺也对鱼肉品质产生了极大影响，甚至还会引起食物中毒，一些国家已经制定了生物胺限定标准。因此，对金枪鱼新鲜度的判断，应将其考虑在内。

近年来，电商的迅速发展使线上购买金枪鱼成为可能，但在流通过程中，金枪鱼的贮藏温度往往得不到有效控制，有时甚至接近室温，其品质保障存在一定隐患。为研究大眼金枪鱼在网购流通过程中的品质变化，研究选取了0、4、15和25 ℃作为流通条件来测定大眼金枪鱼在运输过程中的鲜度指标和8种生物胺在不同温度下的变化规律，最后将鲜度指标和生物胺之间的相关性进行了系统分析和回归方程分析，得出各温度下的最优货架期，以期为网购流通过程中大眼金枪鱼的保鲜和品质保障提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大眼金枪鱼，购自广州金枪鱼专卖店。所购金枪鱼由广州市沛洋食品有限公司于2019年6月捕捞于太平洋近海，船上屠宰冷冻后直接抽真空冻藏于-60 ℃条件下，通过背景生物胺的检测，初始状态组胺浓度为“未检出”。将买回的大眼金枪鱼在无菌环境下等质量切割，分装在自封袋中(该过程在超净工作台进行，提前将工具进行30 min紫外灭菌)。

色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺及丹磺酰氯(纯度≥98 %)，购自美国Sigma公司。高氯酸、盐酸、丙酮、甲基红及碳酸氢钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。琼脂培养基购自广州市普博仪器有限公司。乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，购自上海安谱实验科技股份有限公司。超纯水为实验室自制。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100液相色谱仪(美国 Agilent 公司)；TDZ5-WS台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司)；MILLI-Q超纯水机(美国Millipore公司)；超高能量研磨仪(上海万柏生物科技有限公司)；PB-10精密pH测试仪(德国Sartorius公司)；全自动凯氏定氮仪(丹麦FOSS公司)；台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；0.22 μm针头微孔滤膜一次性过滤器(天津市精拓仪器科技有限公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(上海新苗医疗器械有限公司)；FJ-200高速分散均质机(上海标本模型厂)；明鉴SPX型智能生化培养箱(宁波江南仪器厂)；LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

将分割好的大眼金枪鱼鱼块装入自封袋，为模拟网购流通过程中的贮藏温度，选取0、4、15和25 ℃条件下贮藏鱼肉，分别间隔2d、1d、12h、8h取样5 g，检测大眼金枪鱼pH值、TVB-N、菌落总数、K值以及生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺)的含量。

1.3.2 pH值的测定

参考GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[6]对大眼金枪鱼鱼肉进行测定。

1.3.3 TVB-N的测定

参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[7]，采用自动凯氏定氮仪法进行挥发性盐基氮的测定。

1.3.4 菌落总数的测定

参考GB 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[8]测定菌落总数。

1.3.5 K值的测定

参考SC/T 3048—2014《鱼类鲜度指标K值的测定 高效液相色谱法》进行K值测定[9]，K值计算公式如下：

式(1)

式中：ATP(adenosine triphosphate)为腺苷三磷酸、ADP(adenosine diphosphate)为腺苷二磷酸、AMP(adenosine monophosphate)为腺苷酸、IMP(inosinic acid)为肌苷酸、HxR(inosine)为次黄嘌呤核苷、Hx(hypoxanthine)为次黄嘌呤。各数据单位为μmol/g。

1.3.6 生物胺的测定

参考GB 5009.208—2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》[10]方法测定，前处理采用经优化过后的超声萃取的方法。

1.4 数据分析统计

实验数据用Microsoft Excel 2010进行数据整理并作图，采用 SPSS 23.0 统计分析软件进行显著性和Duncan’s相关性分析，分析结果以平均值±标准偏差(X±SD)表示。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏温度下大眼金枪鱼pH的变化

pH在一定程度上可以用来评价肉类的新鲜程度[11]，大眼金枪鱼肉在0、4、15和25 ℃贮藏期间pH变化如图1所示。4个温度条件下贮藏鱼肉的pH值变化趋势相似，呈先下降后上升的趋势，0 ℃时先下降到5.71，最终上升到6.56；4 ℃时下降到5.99，最终上升到6.36，15 ℃时下降到6.19，最终上升到6.64；25 ℃时下降到6.12，最终上升到6.71。原因在于贮藏初期，鱼体内的糖原和ATP会分解产生乳酸和磷酸，使鱼肉组织的pH下降，酸性增强[12]。而后pH的上升是由于鱼体经过僵直阶段之后，体内水解酶(特别是蛋白酶)和细菌的相关酶[13]会将含氮物质分解为氨基酸和低分子量有机碱[14]，同时鱼肉的品质也在持续下降。该实验结果和Ezati等[15]的研究相似。但仅根据pH来判断网购大眼金枪鱼可否生食还存在不确定性，需要结合多个指标来综合分析判断。

图1 不同贮藏温度下大眼金枪鱼pH随时间的变化趋势Fig.1 Changes of pH during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.2 不同贮藏温度下大眼金枪鱼TVB-N的变化

贮藏过程中，鱼肉中的蛋白质在酶和微生物的作用下被降解为氨和胺类等碱性含氮物质，再与有机酸结合生成挥发性的盐基态氮，TVB-N可作为鱼类贮藏初期的鲜度指标[16]。由图2可知TVB-N的质量分数随着时间的延长而增加，且温度越高，增长速度越快，这与微生物的数量和贮藏的温度密切相关[17]。0 ℃贮藏条件下TVB-N的质量分数增长趋势最为缓慢，贮藏初期的鱼肉中微生物含量低，品质损失主要是由于自身蛋白酶的作用[18]，随着贮藏时间的延长，微生物大量繁殖，胞外蛋白酶的数量增多，在酶的作用下，蛋白质被大量分解，TVB-N的质量分数也随之快速增加，第8天超过了生食金枪鱼标准所规定的250 mg/kg[19]，达到了258.67 mg/kg。随着温度的升高，4 ℃条件下在第6天就达到了281.80 mg/kg，15 ℃时在第48 h达到了295.36 mg/kg，25 ℃条件下微生物和酶的活性最高，TVB-N的质量分数增长趋势最为迅速，32 h就已超出金枪鱼生食标准，达到了264.70 mg/kg。由此可知，网购大眼金枪鱼在运输过程中须保证低温，且尽量缩短运输时间，从而减少TVB-N的产生，保障鱼肉品质。

图2 不同贮藏温度下大眼金枪鱼TVB-N随时间的变化趋势Fig.2 Changes of TVB-N during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.3 不同贮藏温度下大眼金枪鱼菌落总数的变化

菌落总数作为评价水产品品质和安全性的重要指标，在研究水产品鲜度变化时是必不可少的。大眼金枪鱼在0、4、15以及25 ℃贮藏条件下贮藏期间菌落总数的变化如图3所示。相同温度下，菌落总数含量的增长趋势较为稳定，随着温度的升高，在相对适宜的环境中，细菌繁殖速度加快。0 ℃条件下，金枪鱼的菌落总数在第4天超过了生食金枪鱼行业标准所规定的4.0 lg(CFU/g)，达到了4.91 lg(CFU/g)。4 ℃条件下第2天超标，达到了4.40 lg(CFU/g)。15 ℃和25 ℃条件下，分别在12 h和8 h达到了4.29 lg(CFU/g)和4.30 lg(CFU/g)。

图3 不同贮藏温度下大眼金枪鱼菌落总数随时间的变化趋势Fig.3 Changes of aerobic plate count during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.4 不同贮藏温度下大眼金枪鱼K值的变化

早在1959年Saito等[20]就认为K值可作为水产品加工原料的鲜度指标，鱼类死后，ATP会依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR及Hx。大眼金枪鱼在不同贮藏温度和不同时间K值变化趋势如图4所示。在0、4、15和25 ℃贮藏条件下，大眼金枪鱼K值呈上升趋势。0 ℃贮藏过程中K值增长速度最为缓慢(3.53%/d，r2=0.99)，在第2天K值超过20%，不能用于制作生鱼片[21]。在4 ℃贮藏条件下K值增长速度增高(7.33%/d，r2=0.97)，鱼肉可生食期为1天，K值为19.86%。15 ℃条件下K值增长速率明显加快(20.25%/d，r2=0.99)，可生食期仅为12 h。25 ℃条件下K值增长速率最快(35.48%/d，r2=0.99)，可生食期仅为8 h，K值就超过了20%。该结果与汪兰等[21]对鲈(Lateolabraxjaponicus)的研究结果一致。不同温度下K值的增长差异说明了温度影响酶活，进而影响了ATP的降解，因此网购生食金枪鱼需要加强其在流通过程中对温度的控制。

图4 不同贮藏温度下大眼金枪鱼K值随时间的变化趋势Fig.4 Changes of K value during the storage of bigeye tuna(Thunnus obesus) at different temperatures

2.5 不同贮藏温度下大眼金枪鱼生物胺的变化

生物胺是具有生物活性的低分子量有机碱，在新鲜鱼体中主要是由自身的氨基酸脱羧酶对自身前体氨基酸的脱羧作用产生[24]，增长缓慢，随着鱼体死亡，鱼肉中的微生物大量生长[25]，生物胺的含量增长迅速。由图5可知，不同贮藏温度下，生物胺的变化也有所不同。组胺在不同贮藏温度下均呈增长趋势且增长速率要远高于其他生物胺，原因是组氨酸在金枪鱼中的含量较高[26]，从而导致组胺生成量较多，0、4、15和25 ℃贮藏过程中，分别在第8天，第4天，第12 h和第8 h超过了SC/T 3117—2006所规定的90 mg/kg，达到了94.78 mg/kg、136.24 mg/kg、91.98 mg/kg和92.54 mg/kg，不可生食。但根据Guizani等[26]的研究发现，黄鳍金枪鱼(Thunnusalbacores)在0 ℃贮藏条件下鱼肉中的组胺含量有降低的趋势，可能是由于鱼的种类以及鱼肉中存在组胺降解菌的原因[27]，具体因素还需要进一步探究。尸胺、腐胺和酪胺含量的变化与组胺相似，新鲜鱼肉中未检测出尸胺、腐胺和酪胺，随着大眼金枪鱼鱼肉腐败程度的加深, 分别在第4天，第2天，第12 h和第8 h含量迅速增加。色胺的含量在贮藏期间呈下降趋势，苯乙胺，亚精胺和精胺在贮藏期间含量呈增长趋势，但这些生物胺的含量变化都不够明显，因此判断组胺、尸胺、腐胺和酪胺为大眼金枪鱼中的主要生物胺。

图5 0 ℃(a)、4 ℃(b)、15 ℃(c)及25 ℃(d)贮藏条件下生物胺质量分数随时间变化趋势Fig.5 Changes of the biogenic amine mass fraction under 0 ℃(a), 4℃(b), 15℃(c), and 25℃(d) storage conditions

2.6 相关性分析

为分析大眼金枪鱼贮藏过程中鲜度指标和生物胺质量分数之间的关系，根据以上分析结果，对pH值、TVB-N、菌落总数、K值、生物胺质量分数、生物胺指数(biogenic amine index，BAI)以及质量指数(quality index，QI)进行皮尔逊(Pearson)相关系数分析，其分析结果如表1所示。

从表1可知，生物胺质量分数与pH值之间的相关性不显著。在不同贮藏温度下，色胺和TVB-N、菌落总数以及K值呈负相关，但在25 ℃时的相关性不显著。苯乙胺、亚精胺及精胺和鲜度指标的相关性不显著，腐胺、尸胺、组胺和酪胺与鲜度指标的相关性极显著(P<0.01)。BAI为组胺、腐胺、尸胺和酪胺的质量分数之和，其与鲜度指标为极显著相关(P<0.01)。经研究可知，BAI适用于金枪鱼新鲜度的评价，以BAI≤50 mg/kg的金枪鱼定为鱼肉感官品质可接受的范围[28]。QI=(组胺+腐胺+尸胺)/(1+亚精胺+精胺)，最初是用来研究金枪鱼罐头原料的新鲜度，可采用QI作为评价金枪鱼新鲜度的指标，但评价标准应同时以其他指标作为参考[29]，总体以小于10为可接受范围。从相关性分析可知，BAI和QI结果相似，与TVB-N、菌落总数以及K值都有极显著相关性(P<0.01)。将BAI以及QI规定指标与生食金枪鱼的行业标准[19]作对比可知，优质鱼与可食用生鲜鱼的标准存在较大的差异，因此，对于金枪鱼的生食标准，应该综合考虑各方面的影响因素。

表1 大眼金枪鱼中生物胺与pH值、TVB-N、菌落总数和K值的相关性Tab.1 Correlations of biogenic amines with pH Value, TVB-N, aerobic plate count and K Value in bigeye tuna(Thunnus obesus)

2.7 回归方程分析

为进一步明确鲜度指标和各生物胺之间的关系，将经相关性分析后得出的显著相关指标TVB-N、菌落总数和K值作为自变量，BAI和QI作为因变量进行回归分析，建立了不同温度下各个指标间的相关性回归模型(图6～图8)。由图3、图4和图5可知，不同温度下TVB-N、菌落总数和K值与生物胺指标的的拟合度良好，除15 ℃条件下K值与QI的回归模型差异显著(P<0.05)外，其他回归模型均具有极显著差异(P<0.01)。从与BAI的回归系数看，在该回归模型下TVB-N与K值之间的回归性最好，其中TVB-N的∑R2=3.76，菌落总数的∑R2=3.33，K值的∑R2=3.76。从QI的回归系数看，TVB-N的回归性最好，在该回归模型下TVB-N的∑R2=3.54，菌落总数的∑R2=3.39，K值的∑R2=3.45。从BAI与QI的回归系数看，不同温度下BAI要优于QI的回归性，与TVB-N、菌落总数和K值的关系更加密切，更适用于对金枪鱼的鲜度判断。

图6 TVB-N与生物胺指标的回归模型Fig.6 Regression models between TVB-N and biogenic amines indicator

图7 微生物数量与生物胺指标的回归模型Fig.7 Regression models between microbilogical count and biogenic amines indicator

图8 K值与生物胺指标的回归模型Fig.8 Regression models between K value and biogenic amines indicator

3 讨论

本研究对模拟网购生食大眼金枪鱼不同温度条件下的pH、TVB-N、菌落总数、K值和生物胺进行了较为系统的研究，综合考虑相关因素，不同温度下(0、4、15和25 ℃)的生食大眼金枪鱼货架期分别为48、24、12和8 h。实验结果显示，通过pH无法准确判断大眼金枪鱼的新鲜度，随着温度的升高和时间的延长，蛋白质被相关酶大量分解[30]，TVB-N、菌落总数、K值和生物胺质量分数增长迅速，因此温度和时间是控制鱼肉品质的关键，保证低温和降低运输时间可有效延长生食大眼金枪鱼的货架期。通过相关性分析，pH与生物胺质量分数并无显著相关性，TVB-N、菌落总数和K值与生物胺具有显著相关性。大眼金枪鱼的主要生物胺为腐胺、尸胺、组胺和酪胺，BAI以及QI可用来判断生物胺是否超标，综合回归模型结果可知，BAI比QI更适合作为生食大眼金枪鱼的鲜度判断标准。综上所述，TVB-N变化敏感度较低，而K值、菌落总数和生物胺指数的变化基本一致，因此K值、菌落总数和生物胺指数可综合考虑作为流通过程中生食大眼金枪鱼的鲜度判定指标。目前国内外对于生食金枪鱼各有标准，存在一定差异，因此，对于金枪鱼的生食标准，应该综合考虑影响因素，才能确保消费者食用安全。其次，网购金枪鱼在运输过程中温度控制不当，往往在0 ℃以上，甚至接近室温温度，且运输时间在1～3 d不等，这些都将成为消费者生食大眼金枪鱼的安全隐患。如何在网购流通过程中有效控制温度，保障鱼肉品质，还需要进一步深入研究。本研究可为网购生食大眼金枪鱼的贮藏运输以及消费者安全生食提供理论依据。